材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠40 只，雌雄各半，体质量150～170 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级动物房，温度24～26 ℃，相对湿度50%～70%，自由摄食饮水，适应性喂养3 d。
1.2 药物
芍药汤（白芍30 g，黄芩15 g，黄连15 g，大黄9 g，槟榔6 g，木香6 g，当归15 g，肉桂5 g，炙甘草6 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房，经水煮、浓缩、过滤，浓缩成2 mg原药材/mL药液，置于4 ℃冰箱保存。美沙拉嗪缓释颗粒剂，上海爱的发制药集团，0.5 g/袋，批号20160316。
1.3 主要试剂与仪器
HE染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号C0105），10%水合氯醛（天津市凯信公司，批号20170328），TNBS（美国Sigma，批号3LBD6811V）;白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-4 ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号201803），兔抗鼠IL-1β、TNF-α、IL-4抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号BC025840、BC025786、BC025786），辣根酶标记羊抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZB2306）。酶标仪（北京普朗新技术有限公司），洗板机（芬兰Thermo Labsystems），微量高速离心机（型号TG16W，长沙湘智离心机仪器有限公司），隔水式恒温培养箱（型号GNP-9080，常州创威实验仪器厂），光学扫描显微镜（日本Olympus），2235型精密轮转切片机（德国LEICA）。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[3]方法制作UC模型。造模前大鼠禁食24 h，10%水合氯醛（4.0 mL/kg）腹腔注射麻醉，用石蜡油润滑直径0.4 mm软管，插入直肠，深约8 cm，注入5%TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，再将大鼠提尾倒置60 s，使药液充分停留结直肠内。正常组给予等体积生理盐水灌肠。清醒后自由饮水，造模后连续1周从体质量变化、大便形状、便血情况、内脏敏感性、结肠病理等方面进行模型评价。造模7 d后随机抽取2只大鼠解剖，结肠病理显示充血、水肿、炎性细胞浸润、隐窝脓肿、杯状细胞减少、腺体破坏及小溃疡形成等一系列变化，提示造模成功[4]。
2.2 分组和给药
实验大鼠采用随机数字法分为正常组、模型组、美沙拉嗪组（0.067 g/kg）和芍药汤组（1.800 g/kg），每组10只，雌雄各半。美沙拉嗪组和芍药汤组于造模后7 d开始灌胃给药，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。每日1次，2 mL/次，连续7 d。各药均以蒸馏水作溶剂配制，以60 kg成人每日服用药物剂量与160 g大鼠体表面积换算比值换算出大鼠1 d用量，计算各给药组临床等效剂量[5]。
2.3 标本采集和检测
末次给药后禁食、禁水24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉，采血后脱颈处死大鼠，收集血液、结肠组织等进行指标检测，-20 ℃冰箱保存备用。
2.4 一般观察
自肛门处向上取结肠（8±2）cm，沿纵轴剪开，用生理盐水冲洗干净，并进行结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分。0分为无损伤;1分为轻度充血、水肿，无溃疡;2分为肠壁变厚，无溃疡;3分为有溃疡（直径<1 cm）;4分为有溃疡（直径>1 cm），肠管与周围组织无粘连;5分为有溃疡（直径>1 cm），肠管与周围组织有粘连[6]。
2.5 结肠组织病理觀察
4%多聚甲醛固定结肠组织，经脱钙、脱水，石蜡包埋，切片（厚约4～5 μm），二甲苯脱蜡，无水乙醇水合，HE染色固定，镜下观察组织学变化。
2.6 血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4含量检测
取大鼠抗凝全血，4 ℃、2500 r/min离心10 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测。于酶标仪波长450 nm处测定吸光度（A），根据待测样品A值计算相应IL-1β、TNF-α、IL-4的含量。
2.7 结肠组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4蛋白表达检测
取1 cm3大鼠结肠组织，4%多聚甲醛中固定30～60 min，PBS洗涤2次，50 ℃脱水，石蜡包埋，切片（厚约4 μm）。将所有样品脱蜡、水合、灭活、抗原修复处理。5%牛血清白蛋白封闭切片20 min，再与一抗IL-1β（1∶500）、TNF-α（1∶500）、IL-4（1∶500）37 ℃温育1 h，PBS洗涤，将切片与二抗羊抗兔IgG（1∶1000）于20～37 ℃温育20 min，经显色、洗涤、脱水、透化、固定后，镜下观察。应用Motic Advanced 6.0图像分析系统分析。
3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，对样本先进行正态性检验、方差齐性检验，方差齐用LSD法进行组间多重比较，方差不齐用非参数秩和检验，用Kruskal-Wallis H test比较总差异。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状况
造模后1 d大鼠表现精神沉郁，毛发无光泽，耸毛，蜷缩，活动减少，并伴黏液便、血便及体质量下降，造模大鼠有1～2只于造模后7 d内死亡。与正常组比较，模型组大鼠体质量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组体质量显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;与美沙拉嗪组比较，芍药汤组大鼠体质量无显著变化（P>0.05）。见表1。
4.2 结肠组织大体形态变化
模型组大鼠结肠肉眼可见明显充血、水肿，伴见不同程度黏膜糜烂和溃疡，溃疡处肠内容物嵌入，结肠病变处肠腔不同程度扩张变形（见模型组A图）;部分大鼠结肠表面有灰黑色伪膜，肠腔扩张变形明显，结肠与周围组织粘连明显，不易分离（见模型组B图），严重者可出现大段结肠全层改变（见模型组C图）;芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠结肠与周围组织粘连较轻，轻度充血、水肿，结肠黏膜轻度糜烂，肠腔内溃疡范围小、数量少，且溃疡呈愈合性表现。见图1。
4.3 芍药汤对模型大鼠结肠黏膜损伤指数的影响
4.4 结肠组织病理变化
正常组大鼠结肠组织未见或少见炎性细胞浸润;模型组大鼠结肠组织黏膜明显充血、水肿，广泛炎性细胞浸润，杯状细胞减少，溃疡周围腺体缺损且分布杂乱，肠壁广泛纤维化，病变深达黏膜下层、肌层甚至浆膜层，可见炎性肉芽肿;芍药汤组和美沙拉嗪组较模型组大鼠结肠病理改变明显改善，表现轻度充血、水肿，炎性细胞浸润减少，炎性细胞浸润层次变浅，主要集中在黏膜层、黏膜下层，肠壁少量纤维化，部分结肠溃疡周围可见新生腺体，肠壁内可见新生的杯状细胞及肠黏膜层，呈愈合性改变。见图3。
4.5 芍药汤对模型大鼠血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4含量的影响
与正常组比较，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著升高，IL-4含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著降低，IL-4含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与美沙拉嗪组比较，芍药汤组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-4含量无显著改变（P>0.05）。见图4。
4.6 芍药汤对模型大鼠结肠组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠结肠组织IL-1β、TNF-α蛋白表达显著升高，IL-4蛋白表达显著下降，（P<0.01）;与模型组比较，芍药汤组和美沙拉嗪组大鼠结肠组织IL-1β、TNF-α蛋白表达显著降低，IL-4蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）;与美沙拉嗪组比较，芍药汤组大鼠结肠组织IL-1β、TNF-α、IL-4蛋白表达无显著改变（P>0.05）。见图5～图8。
5 讨论
临床上，中医治疗UC有着独特优势，《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见（2017）》将芍药汤确定为治疗大肠湿热证的主方[7]。
近年来，肠黏膜免疫功能紊乱在UC发病中的作用愈发受到重视，促炎细胞因子/抗炎细胞因子的失衡是肠黏膜免疫功能出现紊乱的重要原因[8-9]。促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-4的作用日益凸显。IL-1β通过自分泌或旁分泌方式引起TNF-α、IL-6、IL-8等炎症递质的产生，使局部组织出现急性炎症，进而引起结肠组织充血、水肿、溃疡和坏死等病变[9];而IL-4不仅能抑制炎症的发生、发展，还有一定的免疫抑制功能，故在维持肠黏膜内环境的稳定中至关重要[10]。UC患者血清中IL-1β、IL-4、TNF-α含量可作为评估UC患者病情及预后的重要指标。
本研究发现，TNBS造模后，模型组大鼠一般状况及体质量明显下降，CMDI评分明显升高，结肠组织出现不同程度的病理损伤，该变化符合UC改变，芍药汤能不同程度提升UC大鼠的一般状况和体质量，降低CMDI评分，改善结肠大体形态学及病理损伤，作用与美沙拉嗪无明显差异，提示芍药汤能显著改善UC大鼠的一般形态变化及病理损伤;另外，造模后大鼠血清及结肠组织IL-1β、TNF-α水平升高，IL-4水平降低，给予芍药汤干预，大鼠血清及结肠组织IL-1β、TNF-α的含量和蛋白表达显著降低，IL-4含量和蛋白表达显著升高，效果与美沙拉嗪相当，提示芍药汤改善机体免疫功能可能与调节IL-1β、TNF-α及IL-4等细胞因子的含量和蛋白表达相关，进而减轻结肠组织损伤。
综上所述，芍药汤能显著改善TNBS诱导的UC大鼠结肠组织一般形态及病理变化，并通过影响细胞因子的表达水平，发挥对机体免疫功能的调节作用。鉴于芍药汤临床应用广泛，深入探究芍药汤治疗UC的机制将为临床应用提供依据。
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（收稿日期：2018-12-04）
（修回日期：2019-01-11;编辑：华强）
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