海南三亚豇豆枯萎病病原菌鉴定及室内药剂筛选

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供试菌株于2016 年12月从海南省三亚市崖州区豇豆地枯萎病发病样本上采集分离到，经病健交界处组织分离和纯化培养后，纯化菌株于无菌水中常温保存备用。

1.1.2 供试药剂

供试药剂详见表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离及其形态观察

选取新发病植株的根茎部位，在病健交界处，剪取5 mm大小的组织，参照文献[5]中有关病原真菌的分离方法，进行常规组织分离，经划线分离纯化获得单孢菌株。在PDA培养基上，28℃恒温培养箱培养7 d后，观察菌落形态及分生孢子形态。

1.2.2 病原菌致病性测定

病原菌在PDB培养基震荡培养7 d后，过滤获得孢子悬浮液，将浓度调至108个/mL。采用伤根接种法接种植株。取长势一致，长出3～4片真叶的豇豆幼苗，用无菌水将根部表面冲洗干净，用消毒的剪刀剪掉少许根尖，然后使根完全浸在孢子悬浮液中30 min，最后将植株定植于椰糠基质的花盆中，剩余悬浮液浇灌幼苗根部。每个菌株接种6株苗，设置2次重复，以无菌水为对照。正常栽培管理，10 d后观察发病情况。发病后，从病株再次分离病原菌，确认致病菌。

1.2.3 病原菌ITS序列分析鉴定

（1）菌丝收集 病原菌在PDA平板培养4 d后，用灭菌药匙刮取菌丝，置于4℃保存备用。

（2）DNA提取 CTAB法提取病原菌DNA，将50 mg菌丝体放入已灭菌的2 mL离心管内，每一离心管中加入600 μL 2×CTAB提取缓冲液（0.7 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA；20 g/L CTAB），用电钻将菌丝磨碎后，涡旋混匀，65℃水浴锅中温浴30 min，期间颠倒混匀3次。每管加入600 μL氯仿/异戊醇（体积比24∶1）抽提液，充分混匀后，于12 000 r/min离心15 min。吸取上清液至干净离心管中，加等体积氯仿/异戊醇再抽提1次。将上清转入干净的离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀20 min，12 000 r/min离心10 min，去上清，沉淀用70%冰乙醇冲洗2遍。将离心管置于37℃温箱中干燥后用TE溶解沉淀，经1%脂糖凝胶电泳检测后-20℃冰箱保存，备用。

（3）ITS特异序列扩增 用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。其序列为，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反应条件 PCR反应体系总体积为50 μL，反应液组分：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 24 μL，10 mmol/L d NTP 2 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和 ITS4 （25 μmol/L）各1 μL，用dd H2O使总体积达到50 μL。扩增条件：95℃预变性3 min；94℃变性1 min；56℃退火1 min；72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物委托深圳华大基因公司纯化和测序。

（4）ITS序列分析 将测序所得ITS序列与GenBank 中核酸数据库中的ITS区相关序列进行同源性比较。

1.2.4 供试药剂对病原菌的毒力测定

在预备试验的基础上，选择各药剂对豇豆枯萎病病菌菌丝体生长具有一定抑制作用的4～5个浓度，作为各药剂的供试浓度。供试药剂用无菌水稀释成不同浓度的药液，将PDA培养基熔化，冷却至50℃左右，按照各药剂所需浓度加入适量的药液，倒入灭菌培养皿制成含药平板。每种药剂每个浓度设置3次重复，以加无菌水PDA培养基作空白对照。用直径为5 mm的打孔器打取生长一致的菌饼，置于含药平板中央，28℃恒温培养，待对照菌丝体直径至少 4 cm 以上但不长满皿时，采用十字交叉法测量每个处理的菌落直径，计算生长抑制率，分析不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响。其中，生长抑制率=[（对照菌落直径-0.5）-（处理菌落直径-0.5）]/（对照菌落直径-0.5）×100%。再根据生物统计几率值换算表，将抑制百分率换算成抑制几率值。以试验中设定的浓度对数为横坐标，抑制几率值为纵坐标，计算不同杀菌剂对相应菌株的剂量反应回归方程y=ax+b，并由回归方程计算各药剂对相应菌株的抑制中浓度EC50、EC90及相关系数r值与斜率a值。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离与菌落形态

病原菌在PDA培养基上28℃培养6～7 d后，菌落呈规则圆形，边缘白色，中间淡紫色，气生菌丝茂盛，绒毛状，背面浅紫色，可见同心圆环。挑取菌丝在显微镜下观察可见大量分生孢子，存在2种分生孢子：大型分生孢子、小型分生孢子。大型孢子顶细胞渐尖并弯曲成喙状，基细胞足状，多数为3隔，大小为20.25 μm×4.2 μm；小型孢子數量多，单胞，椭圆形或肾型，大小为8.25 μm×3.01 μm，分生孢子梗在菌丝上直接长出，单瓶梗。厚垣孢子在生长后期出现，球形，间生或顶生。通过对菌落形态、孢子形态等观察，初步鉴定病原菌为尖孢镰刀菌，见图1。

2.2 病原菌致病性测定

接种病原菌孢子悬浮液的豇豆幼苗，植株长势瘦弱，接种10 d，叶片开始变黄萎蔫，13 d 后，叶片皱缩陆续掉落，植株萎蔫枯死，茎基部及根部切面变褐。15 d后，残留的发病残株茎基部可见粉色孢子堆。对照无此症状。对发病植株进行镜检和再次组织分离，获得的菌株与接种的菌株形态一致，证明分离物即为豇豆枯萎病病原，见图2。

2.3 病原菌ITS序列分析鉴定

利用真核通用引物ITS1和ITS4引物进行ITS特异序列扩增，扩增条带位于500～750 bp，约600 bp。测得的序列大小为518 bp在 NCBI 网站比对发现：该 序 列 与Genbank中 的Fusarium oxysporum（登录号为：KX009490.1，GQ121287.1）的相应片段同源性最高，同源性为99%。根据比对结果及形态观察，将该菌鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum. Schl）

2.4 不同供试药剂对病原菌的室内毒力测定

采用10种常用药剂对海南三亚地区的豇豆枯萎病病原菌进行毒力测定，试验结果表明，10种药剂对病原菌菌丝生长均有一定的抑制作用，其中，甲基硫菌灵、乙蒜素、苗迎春3种药剂对病原菌菌丝生长抑制作用明显，其EC50分别为33.58、47.42、51.90 μg/mL。 根美、代森锰锌、百菌清对病原菌菌丝生长的抑制作用也较明显，EC50值分别为53.53、74.26、83.86 μg/mL。为进一步确定供试药剂对豇豆枯萎病病菌的抑制作用，对10种药剂的EC90进行分析比较。其中，EC90值小于500 μg/mL的有2种药剂，分别为乙蒜素、甲基硫菌灵，其EC90值为196.69、325.26 μg/mL。EC90值大于500 μg/mL小于1 000 μg/mL的有代森锰锌、苗迎春，其EC90值为581.06、669.59 μg/mL。

毒力回归曲线的斜率（a值）越大，病原菌对杀菌剂越敏感[6]。10种药剂的毒力回归方程a值范围在0.461 7～2.074 4，a值最大的供试药剂为乙蒜素，a值为2.074 4；其次是代森锰锌，a值为1.434 4；然后是甲基硫菌灵，a值为1.299 6。

综合比较EC50、EC90、a值发现，乙蒜素、甲基硫菌灵、代森锰锌EC50值、EC90值均较小，对豇豆枯萎病病原菌抑制作用较强。而且，a值相对较大，豇豆枯萎病病原菌对该3种药剂较为敏感，见表2。

3 讨论

豇豆枯萎病是豇豆生产常见的土传病害，在海南三亚市豇豆主产区发生严重，田间发病率一般在 5%～20%，严重时达30%以上，甚至绝收。本研究从病原菌形态、致病力测定、ITS序列分析将海南三亚地区的豇豆枯萎病病原菌鉴定为尖孢镰刀菌菌，与吴仁锋等[3]、肖敏等[4]的研究结果一致。但尚未能确定病原菌的专化型种类，有待下一步研究。

枯萎病作为一种严重的土传病害，曾造成多种经济作物的大量减产，目前多数研究对于枯萎病的防治倾向于抗病育种研究，但由于抗病育种需要时间长，且抗病品种容易丧失抗性，因此，在生产实践上，化学防治仍然处于不可代替的地位，生物药剂协同化学药剂防治病虫害也是另一个新的思路。本研究开展了10种常见药剂对豇豆枯萎病的毒力测定试验，结果表明：乙蒜素、甲基硫菌灵、代森锰锌3种药剂对豇豆枯萎病具有较好抑制作用，其EC50值分别为47.42、33.58、74.26 μg/mL；EC90值分别为196.69、325.26、581.06 μg/mL；a值分别为2.074 4、1.299 6、1.434 4，表明豇豆枯萎病病原菌对该3种药剂较为敏感。乙蒜素是大蒜提取物，作为一种仿生植物农药，既对环境友好，又能壮根壮苗，促进植物生长，光谱高效，对多种植物病原菌具有较强抑制作用。张博等[7]发现，乙蒜素在室内或田间条件下对马铃薯致病疫霉菌均具用抑制效果。本研究中，甲基硫菌灵对豇豆枯萎病表现出较强抑制作用，甲基硫菌灵是一种苯并咪唑类杀菌剂，有研究表明，长期单一使用同一种苯并咪唑类杀菌剂，容易导致病原菌产生抗性[8]。因此，在生产中不宜长期单一使用甲基硫菌灵防治豇豆枯萎病。

根据本研究结果，在生产实践中防治豇豆枯萎病建议使用乙蒜素、甲基硫菌灵、代森锰锌轮换使用，可达到良好的防治效果，同时避免产生抗药性。

参考文献

[1] 黄国宋，李秋洁，刘 勇，等. 三亚市冬种豇豆品种比较试验[J]. 热带农业科学，2017，37（1）：53-59.

[2] 徐伟慧，周 岩，吴凤芝. 西瓜枯萎病的研究进展[J]. 中国蔬菜，2013（8）：4-11.

[3]吴仁锋，杨绍丽，万 鹏，等. 豇豆枯萎病病原分离鉴定[J]. 湖北大学学报（自然科学版），2012，34（1）：100-104.

[4] 肖 敏，曾向萍，严婉荣，等. 海南豇豆枯萎病病原鉴定及生物学特性初步研究[J]. 基因组学与应用生物学，2015，34（2）：345-349.

[5] 方中达. 植病研究方法第3版[M]. 北京：中国农业出版社，1998：122-125

[6] 吴伟怀，王彩霞，梁艳琼，等. 11种杀菌剂对甘蔗赤腐病菌的毒力测定[J]. 热带农业科学，2015，35（6）：37-42.

[7] 张 博，马立国，张悦丽，等. 几种生物制剂对致病疫霉的毒力测定[J]. 农药，2017，56（2）：138-140.

[8] 叶 佳，张传清. 葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵、戊唑醇和醚菌酯的敏感性检测[J].農药学学报，2012，14（1）：111-114.

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