材料与方法
1.1 材料
供试甘蔗病害样本分别取自海南省海口、临高、澄迈、文昌、屯昌、白沙、昌江和定安等植蔗区，取生长健壮的甘蔗植株在实验室大棚中盆栽待用。
供试药剂：50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂（江门市大光明农化有限公司）；70%代森锰锌可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）；50%多菌灵可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）；75%百菌清可湿性粉剂（上海亚泰农资有限公司）；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂（江苏龙灯化学有限公司）；10%苯醚甲环唑水分散粒剂（瑞士先正达作物保护有限公司）；65%代森锌可湿性粉剂（上海惠光化学有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离 用常规组织分离法[14]分离病原菌。从蔗区采集表现甘蔗褐条病典型症状的新鲜病叶，用自来水冲洗干净叶片表面，晾干。将病健交界处用手术刀片切成小块病组织（0.5 cm2），然后在超净工作台中，用70%酒精浸泡20 s，0.1%的升汞溶液中消毒1 min，然后用无菌水清洗3次，置于无菌的滤纸上晾干。将病组织块放入含氨苄青霉素的PDA培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d。
待菌落长出后，用接种针挑取菌落边缘的菌丝接种于PDA培养基上28 ℃恒温培养。产孢后进行单孢纯化[15]，观察形态特征并根据孢子形态进行鉴定。
1.2.2 病原菌致病性鉴定 将单孢菌株在PDA培养基上培养至长出孢子后，用无菌水制成孢子悬浮液，将其稀释成孢子浓度为1×106个/mL。采用喷雾法，对健康甘蔗叶片接种（喷无菌水作为对照），套袋保湿24 h，10 d后观察其发病症状是否与田间症状一致，并从发病部位进行病原菌分离，观察孢子的形态特征与原分离菌株的形态特征是否相同。
1.2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析 参照陈吉良等[16]的方法快速高效提取病原菌DNA。引物为真菌通用引物ITS1和ITS4。PCR反应体系为20 μL，包括：10×PCR Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 1.6 μL，ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板1.5 uL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；最后72 ℃ 10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，并进行连接转化，选取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果用BLAST软件进行同源性比对，并用MEGA5.1软件构建系统发育树。
1.2.4 室内毒力的测定 采用菌丝生长速率测定法[17-18]，测定7种农药对甘蔗褐条病病原菌的毒力。7种农药药剂都配制成10 g/L的母液，然后分别用无菌水在预实验的基础上配置成5个浓度梯度的药液，将每种药剂不同稀释度的药液分别加入冷却至60 ℃左右的PDA培养基中，制成含药平板，以无菌水为对照。将甘蔗褐条病病原菌在PDA培养基上28 ℃培养6 d。用灭菌的打孔器（内径6 mm）在培养好的褐条病菌菌落边缘打取菌饼。将菌饼分别移到含药平板中央，每个处理设3次重复。28 ℃恒温培养箱中培养5 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。
抑制率=×100%
根据生物统计机率值换算表，将抑制百分率换算成抑制机率值。用SPSS17.0软件进行统计分析，以处理浓度（mg/L）的对数值为横坐标，相应抑制机率值为纵坐标求出毒力回归方程，并求出抑制中浓度EC50、EC95和相关系数（R）[17]。
2 结果与分析
2.1 病害症状和形态学鉴定
病菌先侵害嫩叶，早期症状呈透明水渍状小点，长约0.5 mm，随后病斑沿主脉平行扩展成水渍状黄色条斑。随后黄色条斑中央出现红色小点，整个病斑变为红褐色，周围狭窄有黄色晕圈，成熟的病斑一般长2～25 mm，有的甚至长达50～75 mm，宽为2～4 mm（图1-A）。发病严重时，条斑联合成大斑块，全叶变为红色；病斑轮廓不明显，病叶提早干枯，植株青叶少，导致病株矮小。
从甘蔗病组织中共分离获得5株菌株，编号为HT1～5。这些菌株在PDA培养基上，菌落呈圆形，灰绿色或淡褐色，边缘菌丝呈灰白色，棉絮状，边缘菌丝较稀薄（图2-A）。镜检观察到分离物菌丝发达，分枝繁茂和分生孢子梗淡褐色（图2-C，D），分生孢子呈橄榄绿色或淡褐色，近纺锤形或长椭圆形，微弯，具有3～11个隔膜，一般7～8个隔膜（图2-B），与杨子林等[3]的报道一致。
2.2 病原菌致病性鉴定
用喷雾法将纯化的菌株回接到健康甘蔗植株上，接种5 d后开始发病，症状与田间自然发病症状相同（图1-B）。从发病植株上再分离得到的菌株在PDA培养基上的培养特性与纯化菌株一致，镜检后观察到相同形态特征的分生孢子，表明所分离到的病原菌是甘蔗褐条病的病原菌。
2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析
用真菌通用引物ITS1/ITS4对致病性最强的菌株HT-4（KM494989）进行PCR扩增其rDNA-ITS序列（图3），扩增产物经测序，目的片段长度为592 bp，将测序结果在NCBI上用BLAST软件进行同源性比对，菌株HT-4与离蠕孢属（Bipolaris）相似性达到99%。然后利用MEGA5.1软件构建系统发育树（图4），从系统发育树可知，所分离到的病原菌与Bipolaris setariae strain CBSHN01（GU290228.1）处于同一个分支，进化上的距离最近，根据上述病原菌的形态特征以及rDNA-ITS序列同源性比较的结果，表明菌株HT-4是甘蔗褐条病的病原菌。
2.4 不同药剂对甘蔗褐条病病原菌的抑制作用
7种供试药剂对甘蔗褐条病病原菌室内毒力测定的结果（表1）表明，7种供试药剂对甘蔗褐条病病原菌均有一定的抑制作用。其中，50%咪鲜胺锰盐和10%苯醚甲环唑对病原菌抑制作用效果最好，EC50值分别为4.400 6 mg/L和9.421 1 mg/L；其次是75%百菌清和70%代森锰锌，EC50值分别为63.242 0 mg/L和37.068 1 mg/L；而65%代森锌、70%甲基硫菌灵、50%多菌灵抑制效果相对较差，EC50值分别为196.594 5、256.573 3、543.184 8 mg/L。在7种供试的杀菌剂中，50%咪鲜胺锰盐的EC95值最小，为20.406 8 mg/L；其次是10%苯醚甲环唑其EC95值为49.155 6 mg/L。而70%代森锰锌、75%百菌清、65%代森锌、70%甲基硫菌灵、50%多菌灵EC95值均高于200 mg/L，分别为291.164 2、1 039.747 4、1 595.173 9、3 156.974 3、4 207.156 4 mg/L。说明不同的供试药剂对甘蔗褐条病菌的毒力存在较大差异。根据毒力回归方程斜率值可判断病菌对药剂浓度变化的敏感性，斜率值越大说明病原菌对药剂的敏感性越强，即：在7种杀菌剂中，甘蔗褐条病菌对50%咪鲜胺锰盐最敏感。
3 讨论与结论
离孺孢属是自然界中分布广泛的一类真菌，可引起禾本科作物及杂草的严重病害，造成巨大的经济损失，也能引起作物发生根腐病[19-20]，如玉米小斑病[21]、稻胡麻叶斑病[22]、小麦根腐病[23]等。甘蔗褐条病菌人工接种可侵染一些禾本科杂草，在自然界中除甘蔗外，还没有在其他植物上发现[5]。目前，关于甘蔗褐条病的研究，仅有杨子林等[3]、陈庭俊[8]、李秋阳等[12]对甘蔗褐条病的发生原因、特点及防治措施进行了报道，而关于甘蔗褐条病菌的分离、鉴定及其致病机理还未见报道。本研究从甘蔗病株上分离到5株菌株，通过致病性测定发现在分离到的5株菌株中，菌株HT-4的致病力最强，接种健康甘蔗叶片后发病速度快，并且接种植株的发病症状与自然发病症状一致，对回接叶片的病斑进行再分离，仍然分离到形态一致的菌株。结合形态学观察和rDNA-ITS序列分析，确定菌株HT-4是引起甘蔗褐条病的病原菌。所分离到菌株与前人报道的甘蔗褐条病菌Bipolaris stenospila（AB179837.1）的rDNA-ITS序列存在一定的差异，推测不同菌株间可能存在遗传多样性。
由于分类系统的复杂性以及病原菌存在生理小种和多样性，导致在病原菌的判定上存在一定的混淆，如甘蔗褐条病早期症状和孢子形状大小均与甘蔗眼斑病相似，但两者在成长斑上存在不同，甘蔗褐条病病斑没有向叶尖产生与叶脉平行的坏死条纹[24-25]。
药剂筛选试验表明，7种药剂对甘蔗褐条病菌都有一定抑制效果，50%咪鲜胺锰盐和10%苯醚甲环唑对该菌的抑制中浓度明显低于其它5种药剂。目前农业上多用多菌灵和甲基硫菌灵来防治该病害[5，12]，而本研究结果表明，50%咪鲜胺锰盐和10%苯醚甲环唑明显比多菌灵和甲基硫菌灵的毒力更强，推测可能是由于长期使用多菌灵和甲基硫菌灵导致甘蔗褐条病菌对其产生了抗药性或不同地区甘蔗褐条病菌对药剂的敏感性不同。因此，筛选防治甘蔗褐条病的有效药剂，需进行药剂的田间试验来验证，找出安全、经济有效的药剂来减少药剂用量、降低环境污染和防止病原菌产生抗药性。
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