[摘要] 本技术生产的可吸收性胶原止血海绵的优点:在保持天然胶原纤维机构的条件下,能有效地去除非胶原蛋白和胶原分子的非螺旋部分,具有纯度高、无免疫反应、稳定性和机械强度好的特性,技术保持领先,生产工艺相对简单,生产成本相对较低,具有一定的推广价值。
[关键词] 可吸收性胶原止血海绵;机械强度;抗原性;生物活性
[中图分类号] R914.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)06(b)-047-03
Research on preparatice technology in absorbable collagen hemostatic sponges
WANG Qiuzhuo, WANG Caihong, ZHANG Wenbo, LIAN Xia
(Hetao University, Linhe 015000, China)
[Abstract] This kind of strong points of absorbed collagen hemostatic sponges are that under the condition of keeping natural collagen fiber structure, it can well get rid of the parts of non-collagen and non-spiral parts of collagen numerator. It has some characteristics of high purity, no immunity reaction, good steady and mechanical intensity, technology is in the end. Technology of production is easy relatively. Production cost is low lelatively. It has some value of popurization.
[Key words] Absorbed collagen hemostatic sponges; Mechanical intensity; Antigenicity; Organism active
在生物材料研究领域,寻找理想的生物材料一直是科学家们研究的焦点,这样的生物材料要求具有生物相容性(Biocompatibility)、可塑性和稳定性,从而满足各种医疗上的要求,包括止血海绵(hemostatic spoges),人造心瓣膜和血管的涂膜(coatings of heart valves and vascular grafts),人造骨和人造皮肤的结构材料(structural conponents for bone and skin grafts),除面部皱纹(wrinkle repair),修补括约肌(spincter correction),角膜手术后的保护膜(comeal shields),以及伤口愈合敷料。几十年的研究发现胶原蛋白完全满足以上的要求,是一种很理想的生物材料。
1 现状
可吸收性胶原止血海绵在美国已有产品上市,临床应用效果很好,目前已在包括脑外科手术、肝和脾脏创伤止血、肾脏手术止血、胃溃疡出血、牙科手术止血、泌尿外科手术止血及皮肤创伤等领域广泛使用。美国是世界上最大的胶原相关医用材料消费国,其目前以胶原为材料的医用器具的市场销售,1997年销售总额为3亿美元左右,且每年有10%左右的增长,分别由Davol,Datsxcope,Intagra,Braun,Ethicon Ine Calcitek等公司生产,以及Astra,J & Jprofessional,Innocol等公司经销,与此同时,载有细胞生长因子或细胞因子重组基因表达载体的胶原止血棉的研究已在探索之中。在美国主要的竞争产品是氧化纤维素和明胶止血海棉。现有的以胶原为材料的医疗器具所用的胶原纤维有两种:①酶化学法提纯的胶原分子重组而成,所得产品纯度很高,但生产工艺相当复杂,成本很高,同时,由于缺乏分子间的交联而使这类产品的稳定性和机械强度不尽人意。②用化学法处理胶原纤维制成,虽然机械强度较好,但由于纯度较差且胶原分子的非螺旋部分没有去除,使它的免疫反应较强,因而其应用受到限制。利用本技术生产的可吸收性胶原止血棉是利用天然胶原纤维良好的止血功能及可靠的纤维机械强度,经过特殊的工艺进行结构修饰,去除胶原分子C端和N端的非螺旋部分,去除其原有的抗原作用而制成的可吸收性止血材料,这种材料具有良好的生物相容性和稳定性,是一种很理想的止血生物材料。目前,国内企业生产的主要是氧化纤维素和明胶止血片,同时也有以甲壳素和海藻类为原料的产品,技术水平低,临床效果不能令人满意,以胶原纤维为材料的产品尚未见上市。
2 机制和特性
2.1 胶原蛋白机制
胶原分子含有特殊的氨基酸序列,这一序列可以和血小板表面的lntegrin(α2β1)(细胞外基质受体)结合,而激活血小板凝结的一系列细胞内反应,但是单个胶原分子所给的信号不足以诱发生理学上的止血功能,这样的止血现象只有血小板同时和多个胶原分子作用才能发生,在胶原纤维中,胶原分子非常有序地排列,从而给血小板提供了最多的结合机会,诱导凝血机制的系列反应发生,经过特殊工艺制备的胶原纤维可制成棉球、棉布或棉带,以满足临床上的各种需要。
2.2 胶原蛋白特性
2.2.1 机械强度 胶原蛋白是人体中最重要的结构蛋白质,已有19种胶原蛋白被确认,在生物材料方面具有应用价值的是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原,Ⅰ和Ⅲ型胶原存在于皮肤筋腱和骨骼中,而Ⅱ型胶原存在于软骨中,其共同的特征是含有由三条蛋白链构成的三股螺旋结构,细胞合成的前胶原(PROCOLLAGEN)在细胞外被转化为成熟的胶原分子,胶原分子进一步组装成胶原纤维,在胶原纤维中,胶原分子非螺旋的羰基和氨基末端的赖氨酸和羟赖氨酸被氧化后会和另一个分子的赖氨酸、羟赖氨酸发生缩合反应,形成分子间的共价结合,经过一系列的缩水和重排,这一分子间的交联转化为更加稳定的键合,从而使胶原纤维具有非常强的机械强度。胶原蛋白纤维可以从组织中直接提取,也可以利用提纯的胶原分子合成。
2.2.2 稳定性由于脯氨酸的羟基化和胶原链的特殊氨基酸序列,胶原蛋白的三股螺旋结构具有非常好的热稳定性,而且对一般的蛋白水解酶具有耐抗性,当胶原分子形成胶原纤维后,它的热稳定性和对蛋白水解酶的耐抗性得到进一步增强。胶原变性后会使它对蛋白质水解酶变得敏感,这些特性增加了胶原的应用范围。
2.2.3 抗原性胶原蛋白的氨基酸组成中甘氨酸占1/3以上,脯氨酸和羟脯氨酸也占相当的比例,它的氨基酸序列为Gly-x-y 的重复,脯氨酸经常出现在x位置上,而羟脯氨酸经常出现在y位置上,这样的简单氨基酸序列使胶原的抗原性非常低,这一特性使胶原制作的生物材料的组织反应非常低而能为人体所相容。
2.2.4 生物活性除了维持各种组织的机械强度,胶原还具有特殊的生物活性。它通过其RGD氨基酸序列和细胞表面的细胞外基质受体(INTEGRIN)结合,所传递的信号保证了组织细胞的生存、生长和分化。胶原纤维和血小板的细胞外基质受体作用可以引起纤维蛋白(Fibrin)凝结,这使胶原纤维可以用于止血。
3 生产工艺流程
生产在符合GMP标准的实验室和车间中进行,环境洁净度控制在1万级,操作温度在4～8℃范围内。生产工艺流程与环境区域划分见图1。
图 1 生产工艺流程与环境区域划分
重点应注意防止细菌污染,匀浆程度,仔细去除非胶原蛋白和胶原的非螺旋部分及蛋白多肽和其他组织细胞成分等。
4 生产过程
生产过程控制如下:
4.1 原料
新鲜牛跟腱,取后即用或速冻(-20℃)保存,避免染菌。
4.2 前处理
剔除黏膜等附着组织,以75%乙醇除菌除脂,不得将杂质带入下一步。
4.3 冷冻、切片
将干净牛跟腱冻好,用切片机切成薄片(1 mm厚)。
4.4 匀浆
10 g牛跟腱(实验室中制作前期样品所用量)中加200 ml去离子水,用切碎机(实验室中少量样品使用切碎机,批量生产时改用胶磨机、匀浆机),打碎、匀浆、保持4℃,每次匀浆30 min至组织悬浮,不见组织片为止,放入冰柜冷却(4℃)。
4.5 提纯、酶化
加入50 ml 5 mol/L NaCl溶液、7.5 ml HAc溶液 及 2.5 ml 10 mg/ml 胃蛋白酶溶液,最终浓度为1 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L HAc溶液、0.1 mg/ml胃蛋白酶溶液,4℃消化两夜。
4.6 成纤维
将上述样品离心(5 000 r/min)30 min,去除上清液,沉淀中加入300 ml 去离子水,匀浆,然后用1 mol/L NaOH调溶液pH至7.0左右,4℃下放置过夜。离心(5 000 r/min)30 min,去除上清液,沉淀中加入300 ml 10 mmol/L HCl溶液,摇荡,然后4℃下放置过夜。匀浆,加1/10体积的0.2 mol/L Na2HPO4调节pH至7.2,4℃下过夜。
4.7 冷冻、干燥
将“4.6”项下样品离心(5 000 r/min)30 min,去除上清液,用去离子水洗涤沉淀,加入200 ml去离子水,充分匀浆,置于模具内,在-50℃下速冻,于冷冻干燥机中干燥,干燥时间28 h,冻干曲线为-45～5℃ 20 h,-5～0℃ 4 h,0～20℃ 4 h。20℃保温4 h。
4.8 分装
用切割机制成规定规格,包装用双层铝膜(PP)包装密封。
4.9 灭菌
用放射性钴γ射线照射,根据不同规格厚度确定照射时间和强度灭菌。
5 质量控制指标
参照美国市场上已有产品的质量控制指标和该产品本身的特点,至少应满足一下指标,①残留胃蛋白酶的含量应低于0.005%;②细菌内毒素应低于0.005 U/mg;③氨基酸组成分析,可以酪氨酸的含量作为判定产品的指标之一,应低于5 AA/1 000 AAA;④组织反应:应鉴定急性和慢性炎症反应;⑤无菌检测按卫生部标准;⑥电子显微镜测定胶原纤维的结构完整性。
6 国内市场分析
根据目前初步调查,我国每年仅脑外科手术就达60万例次,且能作脑外科手术的医院多数在较大城市或经济发达地区,这些消费者能轻易接受到使用新型胶原止血棉,由于市场调查工作困难,对市场需求的预测暂以每年需60万人份的止血棉计,本产品占据1/3市场,显然,实际市场需求远远大于此数目。
美国目前用于制造止血棉的胶原约100 kg,平均每人份胶原止血棉售价为65美元,假定我国定价为每人份200元人民币,按分享1/3的市场,我们需生产20 kg胶原制成20万人份止血棉,年销售额4 000万元,扣除税金280万,成本1 141万,所得税387万等项,年净利润约为2 192万元,经济效益十分可观。
7 结论
本技术原料来源方便,供应量充足,生产工艺相对简单,成本较低,经济效益显著,适合于大规模生产,产品具有领先性,可达到国际最新型生物医用材料的产业化目标,可极大地促进我国在该领域的发展,尤其有利于传统工业的改造。
本项目无有害物质排放,对环境不会产生明显危害。
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(收稿日期:2010-03-12)
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