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1.1 材料
1.1.1 动物 SD大鼠，雄性，180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001，合格证号：11400700163978。
1.1.2 药物 银杏蜜环口服溶液（邛崃天银制药有限公司生产，批号：160312），银杏叶提取物（邛崃天银制药有限公司生产，批号：160402），天麻蜜环菌粉（邛崃天银制药有限公司生产，批号：20151027）；金纳多（银杏叶提取物片，德国威玛舒培博士药厂生产，批号：5260613）；天麻蜜环菌片（江苏神华药业有限公司生产，批号：20160602）。
1.1.3 试剂与仪器 谷氨酸（Glu，≥99%），-氨基丁酸（GABA，≥99.5%），50%氢氧化钠溶液（NaOH），85%磷酸（H3PO4），邻苯二甲醛（OPA），均为HPLC级；硼酸（H3BO3），ACS级，均为Fluka公司产品；β-巯基乙醇（βME，≥99.5%），BR级，磷酸氢二钠（Na2HPO4），ACS级，均为美国Sigma Aldrich公司产品；甲醇（MeOH），乙腈（Acn），HPLC级，美国Fisher Scientific公司产品；高氯酸85%（HClO4），AR级，北京化工试剂二厂产品；水合氯醛，上海国药集团化学试剂有限公司产品；注射用青霉素钠粉针，华北制药股份有限公司产品。TNF-α试剂盒，批号：GR2995505-1，由abcam公司提供。抗体CD34，GFP，NeuN，均由abcam公司提供，批号分别为GR305367-3，GR129953-4和GR249899-29。CoulArray-5600型高效液相-电化学工作站、5600A电化学检测器、582液相泵、542自动进样器、6210碳石墨电极、CTO-324可控温元件箱，美国ESA公司产品。AG2245电子天平，瑞士梅特勒托利多公司产品。UVPMS-BY2 180～212 μm荧光微球，美国Cospheric公司产品，批号：100309-7。YLS-13A大小鼠抓力测定仪，北京众实迪创科技发展有限责任公司。台式MIKRO 22R离心机，德国Hettich公司产品。超声破碎仪，VCX150PB型，美国SONICS公司。针筒式微孔滤膜过滤器：水系（0.22 μm），天津腾达过滤器厂产品。TELTA 320 pH计，上海Mettler Toledo仪器公司产品。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 参考文献[3-4]进行改良，建立多发性脑梗死大鼠模型。动物4.0%水合氯醛腹腔注射麻醉（400 mg/kg），保温毯上仰卧位固定，分离右側颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）及颈外动脉（ECA），结扎ECA并剪断，CCA用丝线打活结暂时阻断，用动脉夹夹闭ICA后，于ECA剪开切口，注射荧光微球混悬血清，致使大脑动脉多发性阻塞。假术组只分离CCA结扎ECA，不注射微球。实验过程中保温毯设定温度37～37.5 ℃，保持大鼠体温。术后24 h动物进行神经学评分，剔除0分及4分大鼠，其余随机分组：假手术组，模型组，金纳多组（18 mg/kg），银杏叶提取物组（9 mg/kg），天麻蜜环菌素片组（600 mg/kg），天麻蜜环菌粉组（300 mg/kg），银杏蜜环口服溶液组（618 mg/kg），银杏蜜环口服溶液组（309 mg/kg）。
1.2.2 给药方法 术后2 d开始灌胃给药，给药体积为5 mL/kg（银杏蜜环口服溶液高剂量组给药体积为6 mL/kg），连续给药28 d。末次给药后动物进行神经功能评分，并测定左前爪抓力。麻醉取血，分离血清冷冻保存，并迅速取出大脑，离后缘4 mm处冠状切一刀，分离纹状体，液氮固化，-80 ℃保存，高效液相-电化学法测定中枢氨基酸类神经递质，后脑区福尔马林固定，经脱水、包埋、切片、HE染色，分析脑组织的病理变化，免疫组化观察微血管、胶质细胞和神经元的修复情况。
1.2.3 行为学检测 术后24 h采用单盲法观察神经行为学。以Longa 5分制评分，其标准为：无神经损伤症状，0分；不能完全伸展左侧前爪，1分；向非缺血侧转圈，2分；行走时向非缺血侧倾倒，3分；不能自发行走，意识昏迷，4分。给药28 d后再次评分
1.2.4 抓力检测 右手抓持大鼠后按放在抓力测定仪的抓力板上，左手向前推住抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手轻轻松开抓力板，待大鼠用左侧前爪用力抓住抓力板时及时加力后拉，测定大鼠的最大抓力。每个动物测定3次，取平均值作为该大鼠的抓力值。
1.2.5 Glu/GABA测定
1.2.5.1 色谱条件 Waters XTerra MS C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，2.5 μm），流动相：100 mM磷酸氢二钠，20%甲醇，3.5%乙腈，pH值（6.70±0.02）。ESA 582液相泵流速为0.4 mL/min；电势+150，+650 mV；柱温30 ℃。氨基酸衍生程序 4 ℃，吸取50 μL衍生工作液，加入25 μL脑匀浆样品中，混合3次，30 μL/次，静置1 min，进样20 μL分析。
1.2.5.2 氨基酸衍生试剂储备液的配制 27 mg OPA，溶于1 mL甲醇，加入5 μL βME，加入9 mL，0.1 mol/L硼酸溶液（NaOH调至pH 9.3），4 ℃保存，5 d内使用。
1.2.5.3 衍生工作液的配制 取2.5 mL氨基酸衍生试剂储备液，加入7.5 mL，0.1 mol/L硼酸溶液（NaOH调至pH 9.3），每日现用现配。
1.2.6 病理学检查 HE染色，光镜下观察脑组织梗死灶、神经元数目、病变程度、小胶质细胞增生程度等形态学指标。
1.2.7 免疫组化 脱水10%中性福尔马林固定，再行梯度脱水（70%酒精60 min×1、80%酒精60 min×1、90%酒精60 min×1、95%酒精60 min×1、100%酒精30-50 min×1、100%酒精60 min×1），透明（二甲苯60 min×2），浸蜡（蜡Ⅰ60 min×1、蜡Ⅱ60 min×1、蜡Ⅲ30 min×1）。包埋：用干净的石蜡融化后浇注组织。切片：切片厚度5 μm。指标检测及检测方法采用PV-6000二步法免疫组化法。采集图像及图像分析：CREB抗体着色表达细胞核，其余抗体着色表达细胞胞质，高倍镜下拍摄3个视野，将采集的图像应用Image-pro Plus 5.1图像分析系统进行分析，所得数据作免疫组织化学染色阳性信号累积光密度（IOD），以IOD值作为组织表达的定量标准。累积光密度（IOD）=平均光密度（AOD）×阳性面积（A）。
1.3 统计学方法 剔除死亡动物后，各组数据以均值±标准差（±s）表示。数据用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学分析，以One-way ANOVA进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对MCI大鼠神经功能评分和抓力的影响 术后24 h进行为学评分，假手术组动物神经行为未发现异常；手术造成大鼠肢体行为学异常，可见明显的神经功能损伤，主要表现为左肩内收、屈曲，前肢无力，向非缺血侧转圈，行走时向非缺血侧倾倒等。按评分标准进行评分，去掉4分和0分大鼠并随机分组，使组间差异没有统计学意义，但与假手术组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。给药28 d后，模型组行为学功能变化不大，与模型组比较，对照药金纳多18 mg/kg剂量组和银杏蜜环口服溶液618 mg/kg和309 mg/kg均有改善神经症状的作用，其中银杏蜜环口服溶液618 mg/kg作用最强，309 mg/kg次之，但与金纳多组比较差异无统计学意义（P>0.05）。给药28 d后，与假手术组大鼠比较，MCI模型组大鼠抓力显著减小，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组大鼠比较，对照药金纳多组、银杏叶提取物组以及银杏蜜环口服溶液618 mg/kg和309 mg/kg组大鼠抓力均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05～0.01），与蜜环菌片及蜜环菌粉比较，差异有统计学意义（P<0.05～0.01）。见表1。
2.2 对MCI大鼠脑组织谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）的影响 模型组大鼠脑组织内脑内谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）水平有所增加，与假手术组大鼠比较，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组大鼠比较，银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组大鼠脑组织中Glu水平显著降低；蜜环菌片600 mg/kg组、银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组及309 mg/kg组的GABA水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05～0.01），金纳多、银杏叶提取物和天麻蜜环菌粉因大鼠个体差异较大，数据无统计学意义（P>0.05）。银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组与
金纳多组比较，Glu水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组与金纳多、银杏叶提取物组比较，GABA水平下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 对MCI大鼠血清TNF-α的影响 模型组大鼠血清TNF-α水平升高，与假手术组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，金纳多18 mg/kg组，天麻蜜环菌片600 mg/kg组，银杏蜜环口服溶液618 mg/kg和309 mg/kg组大鼠血清TNF-α水平均显著降低（P<0.05～0.01），以天麻蜜环菌片600 mg/kg组，银杏蜜环口服溶液618 mg/kg和309 mg/kg组最优，天麻蜜环菌片600 mg/kg组与金纳多组、银杏叶提取物组以及天麻蜜环菌粉组比较，差异均有统计学意义（P<0.05～0.01）；银杏蜜环口服溶液618 mg/kg和309 mg/kg組与金纳多组、银杏叶提取物组、天麻蜜环菌片组以及天麻蜜环菌粉组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表3。
2.4 对MCI大鼠脑组织病理形态的影响 假手术组：脑组织均未见明显异常，未见组织坏死灶及神经元变性/坏死。模型组脑组织标本均可见脑组织坏死灶，发生区域以单侧丘脑区坏死灶最为常见，其次为大脑皮质和海马区；主要表现为丘脑组织局灶性、多灶性或片状坏死，坏死区可见组织细颗粒样崩解或中央液化性坏死，神经元变性/坏死（皱缩浓染）或消失，可伴炎细胞浸润，以及坏死区和周围组织胶质细胞增生、组织空泡形成等坏死后修复反应；大脑皮质可见明显组织坏死所致组织溶解缺失。与模型组比较，金纳多组、银杏蜜环口服溶液309 mg/kg组和618 mg/kg组脑组织坏死发生率均明显降低，程度亦有明显减轻，这3组脑组织均以坏死后组织修复反应为主要表现，坏死急性期的反应如组织崩解和液化性坏死发生率较低或程度较轻，大脑皮质均
未见明显组织坏死，可明显缓解和改善动物脑梗死状态；天麻蜜环菌片组脑组织坏死发生率和病变程度亦有降低，但不如上述3组明显；天麻蜜环菌粉组脑组织坏死发生率略有降低，但病变程度无明显降低；银杏叶提取物9 mg/kg组脑组织坏死发生率和病变程度均无明显降低，对缓解和改善动物脑梗死状态效果不显著。见图1。
2.5 对MCI大鼠脑CD34、GFAP和NeuN表达的影响 免疫组化结果显示，模型组CD34、GFAP阳性细胞数增多，表明坏死组织在修复；银杏蜜环口服溶液309 mg/kg组和618 mg/kg组脑组织的CD34和蜜环菌粉组、银杏蜜环口服溶液309 mg/kg组和618 mg/kg组脑组织的GFAP着色更重，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05），表明修复作用强于模型组。模型组NeuN正常着色减少，坏死程度较重，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；天麻蜜环菌片600 mg/kg组，天麻蜜环菌粉300 mg/kg组，银杏叶提取物9 mg/kg组及银杏蜜环口服溶液618 mg/kg组的NeuN着色加强，与模型组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。提示银杏蜜环口服溶液对缓解和改善动物脑梗死状态有促进作用，对血管内皮、胶质细胞以及神经元均有修复作用。见表4，图2～4。
3 讨论
Glu是哺乳动物中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，研究发现Glu可以有效促使培养的成人脊髓神经元以及成人海马神经元恢复神经电生理活动。不仅如此，生理状态下Glu通过激活兴奋性氨基酸受体对神经元的分化、中枢神经系统的发育、神经元-胶质细胞耦联以及长时程增强效应和记忆的形成都有重要作用。只有在脑缺血缺氧急性损伤等病理情况下，Glu过度释放，在神经元外周间隙大量积聚时，可造成神经元损伤。正常情况下，GABA受体的激活起到抑制兴奋毒性、镇静、催眠、抗惊厥、降血压等生理作用，但在脑缺血时，其过度激活却对神经细胞有毒性作用[5]。本研究结果显示，模型大鼠脑组织内谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）水平显著升高，银杏蜜环口服溶液经口给药28 d，脑内Glu和GABA水平显著降低。
脑缺血发生后，会有一列的细胞因子介导炎性反应，肿瘤坏死因子（TNF-α）就是其中之一。TNF-α是一种多肽类细胞因子，主要是由激活的单核巨噬细胞分泌产生的细胞因子，T细胞、B细胞、血管内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元都是其分泌细胞[6]。脑缺血发生时，TNF-α能介导白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）和前列腺素E2（PGE2）等多种炎性递质的产生。TNF-α还可以通过上调血管内皮细胞和白细胞上的黏附因子（ICAM-1）的表达加剧脑内炎性反应，增加血管通透性[7]；TNF-α还可刺激前列环素（PGI2）和血栓素B2（TXB2）的释放，引起血管收缩和血小板聚集。TNF-α的水平与脑梗死以及行为障碍程度呈正相关[8]。本研究观察到模型组大鼠血清TNF-α水平升高，银杏蜜环口服溶液组血清TNF-α水平显著下降。
CD34、GFAP、NeuN这3种抗体均可用来评价脑组织坏死后血管内皮、胶质细胞及神经元的修复反应[9-11]，CD34和GFAP染色越强，说明组织修复越明显，在组织坏死及修复早期，这2种抗体染色较强，在组织修复后期会逐渐减弱。本研究观察到模型组大鼠CD34、GFAP染色强于假手术组，表明脑损伤后脑组织有自修复的作用，灌胃给药后，银杏蜜环口服溶液组大鼠脑组织中CD34、GFAP染色强于模型组，表明血管内皮、胶质细胞的修复作用进一步增强。NeuN正常着色减少越明显，说明脑组织坏死越严重，坏死周围组织NeuN加深，可能提示坏死组织有修复趋势。本研究观察到模型组NeuN着色减轻，银杏蜜环口服溶液组着色加深，表明有明显的组织修复作用。
此外，银杏蜜环口服溶液对神经功能的改善和抑制脑内Glu、GABA过度释放作用显著优于银杏叶提取物；增加抓力作用显著优于天麻蜜环菌；降低血清TNF-α水平程度则同时优于两者。结论：银杏蜜环口服溶液有保护脑缺血，改善神经功能的作用，复方优于单一组份，且有一定的协同增效的作用。
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（2017-12-20收稿 责任编辑：张文婷）
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