[摘要] 目的 探討华蟾素注射液对结肠癌移植瘤血管新生的影响。 方法 皮下注射CT26细胞，建立结肠癌移植瘤模型。造模成功后采用随机数字表法将20只荷瘤小鼠随机分成五组，即华蟾素注射液高剂量组（CINO-H组）、华蟾素注射液中剂量组（CINO-M组）、华蟾素注射液低剂量组（CINO-L组）、5-氟尿嘧啶（5-FU）组及生理盐水组，每组4只。CINO-H组给予华蟾素注射液0.5 mL，CINO-M组给予华蟾素注射液0.25 mL+生理盐水0.25 mL，CINO-L组给予华蟾素注射液0.125 mL+生理盐水0.375 mL，5-FU组给予5-FU注射液（20 mg/kg），用生理盐水配制成0.5 mL，生理盐水组给予生理盐水0.5 mL。每天腹腔内注射给药1次，连续给药7 d。观察小鼠一般状态、移植瘤大小、组织病理学及微血管密度（MVD）。 结果 5-FU组瘤体积明显小于生理盐水组，差异有统计学意义（P < 0.05），但华蟾素注射液各剂量组与生理盐水组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。从组织病理学观察可得，华蟾素注射液可使瘤体呈现不同程度的坏死，但坏死程度不如5-FU。华蟾素注射液各剂量组MVD均较生理盐水组明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而5-FU组MVD与生理盐水组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 华蟾素注射液能抑制肿瘤组织血管新生，减少瘤体内MVD，抑制肿瘤的生长。
[关键词] 华蟾素注射液；血管新生；结肠癌；抑瘤；小鼠
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（b）-0004-05
Anti-tumor-angiogenesis effect of Cinobufagin Injection on colon cancer transplantation model
FENG Baoyue* YANG Ying* WANG Chaoran ZHENG Junchao FEI Pengfei HU Ye WU Na ZUO Minghuan
Oncology Department， Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China
[Abstract] Objective To investigate anti-tumor-angiogenesis effect of Cinobufagin Injection on colon cancer transplantation model. Methods Mice were administered with CT26 cells by subcutaneous injection to establish colon cancer transplantation model. Then， modeled mice were divided randomly into 5 groups： high dose of Cinobufagin Injection group （CINO-H group）， medium dose of Cinobufagin Injection group （CINO-M group）， low dose of Cinobufagin Injection group （CINO-L group）， 5-Fluorouracil （5-FU） group and normal saline group， with 4 mice in each group. CINO-H group was given Cinobufagin Injection 0.5 mL， CINO-M group was given Cinobufagin Injection 0.25 mL + normal saline 0.25 mL， CINO-L group was given Cinobufagin Injection 0.125 mL+normal saline 0.375 mL， 5-FU group was given 5-FU Injection 20 mg/kg， allocated to 0.5 mL with normal saline， normal saline group was given normal saline 0.5 mL. The mice were injected intraperitoneally with drugs once a day， for 7 days. Tumor formation conditions were observed， and pathological examination of transplanted tumor and tumor microvascular density （MVD） was measured. Results The tumor volume of 5-FU group was lower than that of normal saline group （P < 0.05）， but there was no statistically significant difference in tumor volume between all Cinobufagin Injection groups and normal saline group （P > 0.05）. Histopathological observation showed that Cinobufagin Injection caused the tumor necrosis in different degrees， which was inferior to 5-FU. All Cinobufagin Injection groups decreased MVD in tumor， and significant difference was shown in comparison with those in normal saline group （P < 0.01）. While， 5-FU group couldn"t decrease MVD in tumor （P > 0.05）. Conclusion Cinobufagin Injection can decrease MVD in tumor by inhibiting tumor-angiogenesis， thus inhibiting tumor growth.
[Key words] Cinobufagin Injection； Angiogenesis； Colon cancer； Tumor suppression； Mice
华蟾素注射液为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的全皮经提取加工制成的水溶性成分，其药性属寒凉，具有清热解毒、利水消肿等功效，临床上多用于治疗辨证为阳毒证的患者。现代研究发现，华蟾素注射液具有抑制肿瘤细胞繁殖、诱导细胞凋亡、逆转耐药、增强机体免疫力、镇痛、抗炎等作用[1]。临床上已广泛应用于多种恶性肿瘤及其并发症的治疗[2]，并获得了良好的临床疗效。
前期临床研究发现，华蟾素注射液在治疗癌性胸腹水时，不仅能够有效抑制胸腹水生成，还能够使血性胸腹水颜色变浅，甚至转至淡黄色，降低胸腹水中红细胞的数量[3-5]。而癌性胸腹水的产生与肿瘤血管新生有着密不可分的关系，肿瘤新生血管结构不完整，血管通透性增加，导致管腔内成分漏出至浆膜腔形成恶性胸腹水[6]。李泉旺教授在使用华蟾素注射液进行肝动脉泵入时发现其能缩小血管管径，增大血管阻力，且该收缩血管作用部分是不可逆的[7]。基于以上临床研究，笔者推论华蟾素注射液可能存在对肿瘤血管新生的抑制作用。因此，笔者设计如下实验研究进行华蟾素注射液抑制肿瘤血管的探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞株
动物选取6～8周龄（16～18 g）的雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（实验动物质量合格证编号为SCXK京2016-0011），洁净度：SPF级，饲养条件：12 h光照/12 h黑夜循环，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，所有饮用水、饲料及笼具均经无菌消毒处理。细胞选取鼠源结肠癌CT26细胞，购自国家实验细胞资源共享平台。
1.2 主要试剂
华蟾素注射液（安徽华润金蟾有限公司，批号：150119-2，规格：5 mL/支）；5-FU注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号：1708091，规格10 mL∶0.25 g）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM（Invitrogen，美国）；anti-CD34抗体（Abcam，美国）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（HRP，北京中杉金桥生物技术有限公司）；鼠超敏二步法免疫组化检测试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.3 单细胞悬液制备
将鼠结肠癌CT26细胞培养于DMEM完全培养基（内含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，CORNING公司产品）中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱内培养，取对数生长期的细胞，用0.05%胰蛋白酶消化，机械吹打成单细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加适量生理盐水调整细胞浓度至1×107/mL。
1.4 动物模型制备
取CT26单细胞悬液0.2 mL（浓度为1×107/mL），采用皮下注射法，接种于20只6～8周龄的BALB/c雌性小鼠右侧腋窝皮下。SPF条件下饲养，所有饮用水、饲料及笼具均经无菌消毒处理。
1.5 分组及给药
采用随机数字表法将造模成功（可触及腋下肿块）的20只小鼠随机分成五组，每组4只。华蟾素注射液高剂量组（CINO-H组）：华蟾素注射液0.5 mL；华蟾素注射液中剂量组（CINO-M组）：华蟾素注射液0.25 mL+生理盐水0.25 mL；华蟾素注射液低剂量组（CINO-L组）：华蟾素注射液0.125 mL+生理盐水0.375 mL；5-氟尿嘧啶（5-FU）组：5-FU注射液（20 mg/kg）用生理盐水配制成0.5 mL；生理盐水组：生理盐水0.5 mL。各模型小鼠采用腹腔内注射给予相应药物，每天给药1次，连续给药7 d。
1.6 观察指标与检测方法
1.6.1 一般状况观察
每天观察每只小鼠的活动情况，称量体重，记录小鼠皮下肿塊情况。
1.6.2 瘤体体积测量
用药7 d后，颈椎脱臼法处死并解剖小鼠，完整分离皮下瘤体，用生理盐水漂洗至无血水，用游标卡尺测量瘤体的长径（a）、短径（b），计算瘤体积（V）=ab2/2。
1.6.3 组织病理学观察
按分组将剥离的组织置于4%多聚甲醛固定液中固定，脱水、浸蜡包埋、常规切片后，采用HE染色法，光镜下观察细胞和组织结构的变化。
1.6.4 瘤内血管密度检测
1.6.4.1 免疫组化检测肿瘤血管（CD34标记） ①标本切片：将组织脱水、浸蜡包埋、常规切片，石蜡切片常规脱蜡至水。②染色：3%H2O2室温孵育10 min，以去除内源性过氧化物酶，PBS冲洗5 min×3次；滴加复合溶化液，室温孵育10 min，蒸馏水洗2 min×3次；滴加正常山羊血清，室温10 min，甩去多余液体，不洗；滴加抗CD34抗体，37℃孵育2 h后，0.1 mol/L PBS冲洗，2 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min，0.1 mol/L PBS冲洗，2 min×3次；滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）37℃孵育20 min，0.1 mol/L PBS冲洗，5 min×4次。③显色：DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；苏木精复染，脱水，透明，封片。④观察与计数：光学显微镜下观察并计数肿瘤血管。
1.6.4.2 结果判定标准 血管内皮细胞表面CD34阳性被染成棕黄色。由血管内皮细胞形成的条状、隙状等孤立或簇状结构并有管腔，且管腔小于8个细胞大小者为1条血管；相互分离的血管内皮细胞但无明显管腔亦按1条血管计数。血管腔大于8个细胞或管壁可见平滑肌者不计入内。
1.6.4.3 微血管密度计数方法 参照Weidner等[8]的方法，先在低倍镜下（100×）确定CD34阳性着色最密集的区域，然后在高倍视野（200×）下计数微血管，随机选取5个视野的均值作为微血管密度（MVD）。肿瘤内硬化区域和肿瘤细胞稀少区域内的微血管不进行计数。
1.7 统计学方法
采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，如组间差异有统计学意义，则进行各两组间LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况观察
皮下接种后4 d，个别小鼠腋下可触及瘤体，质硬，活动度差，触碰时小鼠无疼痛躲避现象；皮下接种后7 d，约半数小鼠腋下可摸及瘤体，个别小鼠肉眼可见绿豆大小肿块；皮下接种后10 d，所有小鼠腋下可摸及瘤体，部分小鼠肉眼可见大小不等肿块。皮下接种后11 d开始给予小鼠相应药物治疗，腋下肿块继续长大，部分小鼠甚至侵犯右侧前肢，影响其行走、活动。整个实验周期内，小鼠的进食水情况尚可，未见明显消瘦。小鼠活动情况尚可，部分小鼠因瘤体位置特殊，影响其日常活动，未出现明显活动耐力下降等情况。见图1。
2.2 各组瘤体积比较
完整剥离瘤体后，用游标卡尺测量瘤体长径、短径，计算瘤体积，5-FU组与生理盐水组瘤体积差异有统计学意义（P < 0.05），而华蟾素注射液各剂量组与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。但从表中数据可见，抑瘤效果的变化趋势表现为5-FU组>CINO-H组>CINO-M组>CINO-L组>生理盐水组。见表1。
2.3 各组瘤体组织细胞学比较
光镜下（HE，200×）观察，各组瘤组织细胞多呈圆形或椭圆形，大小、形态不一，核大，核仁明显，核分裂象易见，并有病理性分裂象。华蟾素注射液各组瘤组织结构欠完整，癌细胞排列不规则，可见片状瘤组织坏死。5-FU组瘤组织结构不完整，癌细胞排列不规则，散在分布，可见大片状瘤组织坏死。生理盐水组瘤组织结构尚好，癌细胞排列成条索状或巢团状，间质少。见图2。
2.4 各组瘤体内MVD比较
由表2可知，华蟾素注射液各组均能明显降低肿瘤组织的MVD，与生理盐水组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），同时随着华蟾素注射液浓度的升高，瘤体内MVD有减少的趋势，但是华蟾素注射液各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。而5-FU组与生理盐水组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。由图3（封三）可见，视野中血管内皮细胞被染成了棕黄色，圆形、条状、隙状的管腔清晰可见，同样大小的视野内，华蟾素注射液各组的血管数量随浓度增加而减少，5-FU组与生理盐水组的血管数量则区别不大。
3 讨论
肿瘤血管在肿瘤生长、转移中发挥着重要作用。当肿瘤直径小于2 mm时，肿瘤细胞依靠弥散的方式从周围组织获取营养和排泄代谢废物，因此肿瘤生长缓慢，缺乏侵袭性，不容易发生转移。而当实体肿瘤直径超过2 mm时，肿瘤的生长所需的养分急剧增加，此时就需要依靠血管来供应营养物质及排泄代谢产物，否则肿瘤将因缺乏营养而停止生长甚至坏死[9]。远处转移是恶性肿瘤晚期最重要的死因。肿瘤细胞通过结构不完整的新生血管转移至远处脏器或腹膜，如出现肝转移、恶性腹水等并发症，致使患者的生存率大大降低，生活质量严重下降。因此，抑制肿瘤新生血管的形成在治疗恶性肿瘤转移方面具有重要意义。
本研究通过观察华蟾素注射液对结肠癌移植瘤血管生成的抑制作用，阐明华蟾素注射液抑瘤的另一方面作用机制。实验结果说明华蟾素注射液可作用于结肠癌组织的微血管，具有明显抑制血管生成的作用，使肿瘤组织的血供减少，组织学观察发现瘤组织有不同程度的壞死。该结论与既往实验研究结果相一致。刘浩等[10]亦通过华蟾素作用于Lewis肺癌荷瘤小鼠发现华蟾素具有抑制肿瘤血管生成的作用，其作用机制与调控VEGF/VEGFR-2信号传导有关。刘琳等[11]探讨三氧化二砷联合华蟾素对裸鼠人肝癌移植瘤血管新生的作用及其相关机制，也发现华蟾素可降低肿瘤MVD，联合三氧化二砷可使抑制作用加强。综上所述，华蟾素注射液能抑制肿瘤血管新生，减少快速增生的瘤组织的血供、氧供，导致肿瘤的坏死，抑制肿瘤的进一步生长。
研究表明华蟾素注射液确实有明显的抑瘤效果，但在本研究中未能得到证实，分析其原因可能与用药时间和癌细胞种类、接种数量不同等有关。刘浩等[10]通过腹腔注射华蟾素注射液（剂量分为40、20、10 mL/kg）10 d，观察Lewis肺癌（细胞数为2×106/mL）荷瘤小鼠瘤体生长情况，发现华蟾素高、中剂量组对瘤体有一定的抑制作用，抑瘤率在12%～31%之间。薛瑞等[12]通过腹腔注射华蟾素注射液（剂量分为25、50、100 mg/kg）12 d，观察人乳腺癌（细胞数为5×106/mL）皮下移植瘤的生长情况，发现华蟾素注射液可明显抑制荷瘤裸鼠的瘤质量，并且随着华蟾素剂量的增加，抑瘤率增高。朱晓燕等[13]通过观察腹腔注射华蟾素注射液（剂量分为50、25、12.5 mg/kg）21 d对荷人胰腺癌细胞株（细胞数为3×107/mL）裸小鼠的抑瘤作用，发现小剂量组的抑瘤率为16.95%，中剂量组的抑瘤率为30.51%，高剂量组的抑瘤率为18.64%。综上可知，华蟾素注射液对恶性肿瘤生长有一定的抑制作用，但本研究用药时间仅为7 d，可能影响最终实验结果。这可能也与华蟾素注射液各剂量组间MVD无统计学差异有关。
本研究结果提示，华蟾素注射液能抑制肿瘤组织血管新生，减少瘤体内MVD，抑制肿瘤的生长。临床上华蟾素注射液治疗肿瘤晚期恶性腹水、远处转移瘤的效果可能与此作用机制有关。丰富的肿瘤血管为恶性肿瘤转移奠定了良好的血性转移基础，因此，临床上使用华蟾素注射液不仅能抑制肿瘤的生长，还能通过抑制肿瘤血管生成降低恶性肿瘤远处转移的风险。
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