材料与方法
1.1 试验材料
岩扇贝于2016年11月取自辽宁省旅顺河口养殖基地，鉴定后活体解剖取扇贝闭壳肌于液氮冷冻后转-80 ℃超低温冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取和检测 随机选取岩扇贝2个，取大约30 mg闭壳肌组织，尽量剪碎，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并溶解于100 μL Tris-EDTA缓冲buffer（TE溶液）中，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，然后将基因组DNA稀释至50 ng/μL，4 ℃ 下保存备用。
1.2.2 PCR扩增及测序 本试验使用CO Ⅰ和16S引物序列进行PCR扩增（表1），所有PCR反应均采用预混合酶试剂（premix），配制 10 μL 体系，在PTC-100型PCR仪上进行反应。PCR反应程序为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，16S变性1 min，CO Ⅰ和16S分别48 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共运行35个循环;最后1个循环结束后72 ℃再延伸 5 min。PCR产物用含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察、照相。用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司生产]纯化后，进行双向测序。
1.2.4 数据处理 本试验选取2个岩扇贝个体进行测序，所获原始序列首先与其对应峰图对比检查，以确认序列质量;每个个体测得正反向序列并用BioEdit软件进行拼接，结合人工校正;在NCBI数据库中进行Blast比对分析，确定序列准确性。下载扇贝科下物种序列[16]，应用MEGA 7软件检查平均一致度估测联配结果的可信度;计算16S的种内遗传距离;基于CO Ⅰ和16S rDNA，应用邻接树（neighbor joining，简称NJ）法分别重建系统发生树;运用MEGA 7软件Codonusage功能计算同义密码子出现的次数及使用度[17]，16S基因密码子偏好性分析，同义密码子使用度（RSCU）计算公式为
RSCUij=xijx=xij1ni∑nij=1xij。
式中：xij表示编码第i个氨基酸的第j个密码子的出现次数;ni表示编码第i个氨基酸的同义密码子数量（其值为1～6）。当密码子的RSCU值等于1时，表示该密码子没有偏好性;当密码子的RSCU值小于1时，表示该密码子使用较少;当密码子的RSCU值大于1时，表示该密码子使用较多[18]。
2 结果与分析
2.1 岩扇贝CO Ⅰ和16S的DNA序列组成
本研究对岩扇贝的CO Ⅰ和16S基因进行PCR扩增，得到清晰的基因片段扩增产物，纯化后直接进行双向序列测定，经过比对和校正后提交GenBank数据库。测序结果表明，CO Ⅰ 基因片断大小为660 bp，序列的A、T、G、C平均含量分别为17.2%、40.3%、27.2%、15.3%，其中A+T的含量（57%）明显高于 G+C的含量（42%）;16S基因片段大小为613.0～634.0 bp（不包含引物），序列A、T（U）、G、C平均含量分别为26.5%、297%、24.5%、19.3%（表2），其中A+T（U）的含量（56.2%）高于G+C的含量（43.8%）。CO Ⅰ和16S碱基均出现偏倚性，符合线粒体碱基组成的特点。将研究中测定及下载的所有16S序列进行整理，并裁剪为同一长度529 bp进行分析，其保守位点153个，变异位点369个，简约信息位点315个，单独位点54个。
2.2 系统发育树的物种鉴定
本试验选取珍珠贝科马氏珠母贝、牡蛎科长牡蛎、莺蛤科白斑珍珠蛤作为外群，在CO Ⅰ和16S进化树中C. gigantea单独聚为1支，马氏珠母贝（Pinctada martensi），白斑珍珠蛤（Pinctada maculata）聚為1支。CO Ⅰ进化树的p-distance<08，16S序列的Jukes-Cantor分析值为0.246，这2个值分别说明CO Ⅰ和16S所选序列适合构建NJ树。CO Ⅰ的NJ树表明，C. gigantea进化依次接近于栉孔扇贝（Azumapecten farreri），冰岛扇贝（Chlamys islandica），北美扇贝（Patinopecten caurinus），虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis），其中后三者聚为1支（图1）。16S的NJ树表明，岩扇贝5个序列形成具有较高支持度的单分支且依次接近于北美扇贝（Patinopecten caurinus）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）、Chlamys islandica（图2）。扇贝科的5个属，其中类栉孔扇贝属的华贵栉孔扇贝（Mimachlamys nobilis）单独聚为1支;海湾扇贝属的海湾扇贝（Argopecten irradians）、紫扇贝（A. purpuratus）、A. ventricosus聚为1支;栉孔扇贝属的C. farreri、A. farreri和S. livida为1支;掌扇贝属的平濑掌扇贝（Volachlamys hirasei）、新加坡掌扇贝（V. singaporina）聚为1支;盘扇贝属的M. yessoensis、P. caurinus聚为1支，聚类结果基本与传统的分类结果一致。
2.3 岩扇贝中16S基因的密码子偏好性
16S在岩扇贝中扩增偏向使用以U或G结尾的密码子，总使用度分别为12.76、8.02。其中GUU、UUG、AUU、ACG、UAU、CAA、GAG、UUU、UCU、GAU、GGU、GAG、AGG和GGA等25个密码子的RSCU值均大于1，其中GUU的RSCU值大于2，为16S在岩扇贝中偏好性使用次数最多的（表3）。
3 讨论
孔晓瑜等做了栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体16S rRNA基因片段的比较研究，A+T的含量分别为54.73%、55.17%[18]。胡丽萍等在紫扇贝和海湾扇贝中扩增16S，获得基因片段长度均为542 bp，紫扇贝和海湾扇贝的碱基组成 A+T所占比例分别为54.2%、55.1%[19]。朱立静等对四角蛤蜊CO Ⅰ基因的研究表明，四角蛤蜊的G+C含量明显低于A+T含量[20];程汉良等对帘蛤目中6种贝类进行CO Ⅰ序列的扩增结果也表明，A+T含量明显高于G+C含量[21]。这与本研究中CO Ⅰ在岩扇贝中的扩增结果相似。一般认为，
在线粒体基因组中，16S rRNA基因进化速率低，比较保守，而CO Ⅰ基因为变异性较大的区域，在不少无脊椎动物中检测到了较大的变异[22-23]。从本试验结果可以看出，在剪裁为 529 bp 的16S rRNA片段中，其保守位点153个，变异位点369个，变异位点比例达到69.8%，即岩扇贝种内变异率较高，原因可能是16S存在较高的碱基转换和颠换，这部分有待后续进行进一步讨论。
Thompson等认为成对联配的氨基酸序列的平均一致性百分比太低时，多序列联配的结果准确性会下降，一致性百分比等于1减去p-distance[24]。 当p-distance﹤0.8，联配结果是可接受的;当p-distance≥0.8则是不可靠的。本试验CO Ⅰ的p-distance为0.746，对应的一致性为25.4%，介于20%和30%之间的临界区域，氨基酸残基的联配正确率在80%左右，另一项研究表明，氨基酸联配的精确性大于50%时，它对系统进化树准确性的影响就微乎其微了，即该COⅠ系统进化树是可信且可用的[25]。同理，16S序列的Jukes-Cantor分析值为0.246，说明16S的NJ树可信且可用。
Saavedr等分析表明，C. gigantea进化上接近C. islandica，其次是岩扇贝属的其他成员如Crassadoma multistriata、Mimachlamys varia[12]。在本试验16S的NJ树中，C. gigantea更接近P. caurinus和M. yessoensis，其次是C. islandica，在CO Ⅰ的NJ树中更接近于A. farreri，2个NJ树不一致的原因可能是2个基因片段剪裁序列的长度不同导致联配一致度不同。Feng 等研究表明，在CO Ⅰ进化树中芬香海扇蛤（D. plica）、大海扇蛤（P. maximus）、A. pleuronectes、A.irradians聚为1支，在16S进化树中Pecten maximus、Amusium pleuronectes、Argopecten irradians和其他扇贝聚为1支而Decatopecten plica单独聚为1支[16]。
参考文献：
[1]曹善茂，汪 健，王 谦，等. 岩扇贝人工育苗的初步研究[J]. 大连海洋大学学报，2017，32（1）：1-6.
[2]曹善茂，王 昊，陈 炜，等. 岩扇贝闭壳肌营养成分的分析及与中国 3 种扇贝的比较[J]. 大连海洋大学学报，2016，31（5）：544-550.
[3]曹善茂，梁伟锋，汪 健，等. 岩扇贝幼贝滤食率的基础研究[J]. 大连海洋大学学报，2016，31（6）：612-617.
[4]Phleger C F，Holtz R B，Grimes P W，et al.Chemical and sensory analysis of the purple-hinge rock scallo Hinnites multirugosus Gale[J]. Journal of Food Science，1978，43（6）：1793-1796.
[5]Maxwell-Miller G，Josephson R V，Spindler A A，et al.Chilled（5 ℃）and frozen（-18 ℃） storage stability of the purple-hinge rock scallop，Hinnites multirugosus Gale[J]. Journal of Food Science，1982，47（5）：1654-1661.
[6]Monical James B. Comparative studies on growth of the purple-hinge rock scallop Hinnites multirugosus （Gale） in southern California[J]. Journal of the World Aquaculture Society，1979，10（1/2/3/4）：648.
[7]Laurén D J.Oogenesis and protandry in the purple-hinge rock scallop，Hinnites giganteus，in upper Puget Sound，Washington，U.S.A.[J]. Canadian Journal of Zoology，1982，60（10）：2333-2336.
[8]Cary S C，Leighton D L，Phleger C F.Food and feeding strategies in culture of larval and early juvenile purple -hinge rock scallops，Hinnites multirugosus （Gale）[J]. Journal of the World Aquaculture Society，1981，12（1）：156-169.
[9]Culver C S，Richards J B，Page H M.Plasticity of attachment in the purple-hinge rock scallop，Crassadoma gigantea：implications for commercial culture[J]. Aquaculture，2006，254（1/2/3/4）：361-369.
[10]Bernard F R. Crassadoma gen. nov. for “Hinnites”giganteus （Gray，1825） from the North-eastern Pacific Ocean （Bivalvia：Pectinidae）[J]. Venus 1986，45：70-74
[11]Waller T R. The evolution of “Chlamys” （Mollusca：Bivalvia：Pectinidae） in the tropical western Atlantic and eastern Pacific[J]. Am Malacol Bull，1993，10：195-249.
[12]Saavedra C，Pea J B. Phylogenetics of American scallops （Bivalvia：Pectinidae） based on partial 16S and 12S ribosomal RNA gene sequences[J]. Marine Biology，2006，150：111-119.
[13]Hebert P D N，Ratnasingham S，de Waard J R . Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，2003，270（S1）：96-99.
[14]Ball S L，Hebert P D N，Burian S K，et al. Biological identifications of mayflies （Ephemeroptera） using DNA barcodes[J]. Journal of the North American Benthological Society，2005，24（3）：508-524.
[15]程希婷，王愛民，顾志峰，等. DNA条形码研究进展[J]. 基因组学与应用生物学，2011，30（6）：748-758.
[16]Feng Y W，Li Q，Kong L F，et al. DNA barcoding and phylogenetic analysis of Pectinidae （Mollusca：Bivalvia） based on mitochondrial CO Ⅰ and 16S rRNA genes[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（1）：291-299.
[17]宋乔乔，柴志欣，钟金城. 禽流感病毒基因的密码子偏好性及聚类分析[J]. 生物技术，2014，24（2）：48-53.
[18]孔晓瑜，刘亚军，喻子牛，等. 栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体16S rRNA基因片段的比较研究[C]// 中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学分会代表大会暨学术讨论会，1999.
[19]胡丽萍，姜黎明，黄晓婷，等. 基于16S rDNA基因序列探讨引进物种紫扇（Argopecten purpuratus）在海湾扇贝属（Argopecten）中的分类地位[J]. 海洋与湖沼，2016，47（6）：1149-1157.
[20]朱立静，陈淑吟，许晓风，等. 四角蛤蜊江苏群体线粒体CO Ⅰ基因片段序列研究[J]. 江苏农业科学，2010，38（4）：33-35.
[21]程汉良，夏德全，吴婷婷，等. 6种帘蛤科贝类及4个地理种群文蛤线粒体CO Ⅰ基因片段序列分析[J]. 海洋学报，2007，29（5）：109-116.
[22]Howland D E，Hewitt G M. Phylogeny of the colepters based on mitochondrial cytochrome oxidase Ⅰ sequence data[J]. Insect Mol Bio，1995，4：203-205.
[23]Spicer G S . Phylogenetic utility of the mitochondrial cytochrome oxidase gene：molecular evolution of the Drosophila buzzatiispecies complex[J]. Journal of Molecular Evolution，1996，41（6）：749-759.
[24]Thompson J D，Plewniak F，Poch O . A comprehensive comparison of multiple sequence alignment programs[J]. Nucleic Acids Research，1999，27（13）：2682-2690.
[25]Ogdenw T H，Rosenberg M S. Multiple sequence alignment accuracy and phylogenetic inference[J]. Systematic Biology，2006，55（2）：314-328.刘冬梅，娄喜艳，吴 狄，等. 基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发[J]. 江苏农业科学，2019，47（7）：32-35.
相关热词搜索： 扇贝 基因 探讨 地位 分类