摘 要：利用荧光定量PCR技术比较了氯虫苯甲酰胺敏感和抗性种群菜青虫中鱼尼丁受体基因表达量的差异，并研究了低剂量的氯虫苯甲酰胺连续和间断饲喂敏感菜青虫后其鱼尼丁受体基因表达量的变化趋势。结果表明：抗性种群菜青虫鱼尼丁受体基因表达量是敏感种群表达量的 6.32 倍；低剂量的氯虫苯甲酰胺可使菜青虫蛹（3龄幼虫处理后12 d）中的鱼尼丁受体基因表达量显著增加；连续饲喂可使菜青虫鱼尼丁受体基因持续高表达，而间断饲喂后第8天表达量显著降低。
关键词：氯虫苯甲酰胺；菜青虫；鱼尼丁受体基因；表达量
中图分类号：S482.3 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）07-0005-03
菜青虫（Pierisrapae L.）属鳞翅目粉蝶科，是危害十字花科蔬菜的主要害虫之一。2龄前幼虫在叶背啃食叶肉，留下一层透明的表皮；3龄后幼虫啃食表皮，严重时只残留叶脉和叶柄；幼虫取食叶片留下的伤口常导致软腐病的发生，排出的粪便会对叶面和菜心造成污染，影响蔬菜的产量和品质[1]。另外，该虫繁殖能力强、世代周期短，一旦发生即给蔬菜生产带来较大损失。
细胞内Ca2+的变化会引起一系列生理活动的变化，Ca2+的释放主要由两类通道蛋白调节，一类是三磷酸肌醇受体（IP3R），另一类就是鱼尼丁受体（RyR）。在哺乳动物中，鱼尼丁受体存在3种亚型：RyR1、RyR2和RyR3；RyR1和RyR2两种类型主要位于骨骼肌和心肌，而RyR3主要存在于隔膜和大脑[2]。而在昆虫中，仅发现了一种鱼尼丁受体亚型[3]，因此昆虫中的RyR基因对于新型药剂的研发有着重要的作用。
近年来，氯虫苯甲酰胺和氟虫酰胺等以RyR为靶标的杀虫剂相继问世[4-6]。该类杀虫剂可选择性地打开对RyR敏感的Ca2+通道，导致大量的Ca2+从内钙库释放出来，扰乱或破坏细胞质内Ca2+环境的稳定性，从而使肌肉细胞收缩，害虫瘫痪死亡[7-9]。由于氯虫苯甲酰胺可诱导昆虫Ca2+的释放，且该功能在鳞翅目昆虫和哺乳动物中都有效[10]，因此氯虫苯甲酰胺被认为是研究RyR的理想工具之一，同样昆虫RyR基因克隆及其分子特性也成为研究热点[11]。
目前，已有氯虫苯甲酰胺影响小菜蛾鱼尼丁受体基因表达量的相关报道[12]，但对菜青虫鱼尼丁受体基因表达影响的报道还少见。因此，试验以低于亚致死剂量的氯虫苯甲酰胺连续或间断饲喂对该药剂敏感和抗性的菜青虫，研究其对不同菜青虫种群体内鱼尼丁受体基因的表达量差异，以期为阐明氯虫苯甲酰胺的作用机理以及筛选合适的受体化合物提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 虫 源 菜青虫敏感种群：于2009年采自华南农大昆虫毒理实验室，在养虫室内用无虫甘蓝苗进行继代饲养，期间未接触任何杀虫剂。菜青虫抗性种群：当菜青虫敏感种群幼虫多数进入3龄时，以浸渍过氯虫苯甲酰胺的甘蓝叶片进行饲喂，经过连续汰选20代后，其抗性水平达到36.3倍时即为氯虫苯甲酰胺抗性种群。
1.1.2 主要试剂及仪器 试验主要试剂有：95%氯虫苯甲酰胺原药（美国杜邦公司），二甲基甲酰胺（DMF，美国 Sigma 公司），Triton X-100 （北京化工试剂公司）；TRIzol Reagent RNA 提取试剂盒、cDNA合成试剂盒（Invitrogen公司）；脱氧核糖核酸酶（DNase）、Taq DNA聚合酶（Promega公司），Real time PCR Master Mix试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。试验的主要仪器为荧光定量PCR仪（ABI 7500，美国ABI公司）。
1.1.3 反应引物 根据菜青虫鱼尼丁受体基因在 Genebank 上的登陆序列（登录号JX4817768），设计一对特异性引物 PrRyF 和 PrRyR；同时以 18SrRNA 作为内参基因，特异引物为 18SrRNAF 和 18SrRNAR。PrRyF：5′-AGAGGGAACTGGGATGC-3′，PrRyR：5′-ACCTGACAGCGACACCA-3′；18SrRNAF：5′-ACAATTGGAGGGCAAGTCTG-3′，18SrRNAR：5′-CACCGCGATAGGA TTTTGAT-3′。引物由上海生工有限公司合成，引物浓度均为50 μmol/L。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计 将氯虫苯甲酰胺原药用DMF进行梯度稀释，并向稀释的溶液中加入1‰ Triton X-100，进行生测试验，对照组采用清水试验。生测试验结果显示氯虫苯甲酰胺对3龄菜青虫的致死中浓度（LC50）为0.1 mg/L。因此，试验选择0.02 mg/L的氯虫苯甲酰胺浸渍甘蓝叶片，连续或间断饲喂3龄的菜青虫幼虫敏感和抗性种群。（1）不同菜青虫种群的鱼尼丁受体基因表达量受氯虫苯甲酰胺的影响：以3龄菜青虫幼虫的抗性种群和敏感种群为对象，直接测定其鱼尼丁受体基因表达量。（2）敏感菜青虫不同发育阶段鱼尼丁受体基因表达受氯虫苯甲酰胺的影响：先以浸渍过氯虫苯甲酰胺的甘蓝叶片连续饲养3龄敏感菜青虫幼虫4 d，然后继续以未接触过药剂的甘蓝叶片进行饲养，并分别于处理后第l、4、8、12天取样，测定其鱼尼丁受体基因表达量。（3）连续和间断饲喂对敏感菜青虫鱼尼丁受体基因表达量的影响：间断处理同上，连续饲喂则以浸渍过氯虫苯甲酰胺的甘蓝叶片连续饲喂3龄敏感菜青虫，分别于处理后第l、4、8、12 天取样，测定其鱼尼丁受体基因表达量，以不用药剂处理的菜青虫鱼尼丁受体基因表达量为对照，计算连续饲喂和间断饲喂对菜青虫鱼尼丁受体基因表达量变化值。所有样品取得后均迅速置于液氮中冷却，并于﹣80℃冰箱中保存备用。
1.2.2 荧光定量PCR反应参数 （1）总RNA提取。取100 mg敏感的菜青虫幼虫，采用Trizol（Invitrogen）试剂提取总RNA。（2）反转录。按照cDNA合成试剂盒进行反转录；反应体系（10 μL）：RNA模版 5 μL，Oligo（dt）引物1 μL，反转录酶混合物1 μL，含dNTP mixture和Mg2+的反转录缓冲液1 μL，0.1%的DEPC水2 μL；反转录程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s；产物置于﹣20℃下备用。（3）荧光定量PCR。反应体系（25 μL）：2.5×Real Master Mix（SYBR Green）11.25 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，去RNA酶的ddH2O11.75 μL；反应程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s，40个循环。阴性对照以去RNA酶的ddH2O为模板，单个样品重复4次，定量数据通过定量仪器自带的软件进行分析，并采用文献[13]的方法进行计算。
1.2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 以提取的菜青虫cDNA为模板按1×51、1×52、1×53、1×54和1×55倍进行稀释，利用特异性引物分别对目的片段和18S rRNA以1.2.2中的反应条件进行荧光定量PCR，以稀释度的负对数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立荧光定量PCR标准曲线。
1.3 数据统计与分析
用SPSS统计分析软件对数据进行差异显著性分析（HSD法），取0.05显著性水平。
2 结果与分析
2.1 荧光定量PCR标准曲线的建立
从图1中看出，在试验设计的浓度范围内（5个数量级，Ct值在20～32之间）荧光定量PCR呈现出较好的线性关系。菜青虫内参基因18SrRNA的标准曲线为：y=−3.423 5 x+17.472，R2=0.995 6，扩增效率为95.9%；菜青虫鱼尼丁受体基因RyR的标准曲线为：y= −3.345 6 x+20.008，R2=0.997 5，扩增效率为99.0%。这表明设定的荧光定量PCR参数符合试验要求，可实现目的基因和内参基因的扩增效果。
2.2 氯虫苯甲酰胺敏感与抗性菜青虫种群鱼尼丁受体基因表达量的差异
由图2可知，氯虫苯甲酰胺抗性种群菜青虫中的鱼尼丁受体基因表达量显著高于敏感种群的表达量，以敏感种群菜青虫鱼尼丁受体基因表达量作为基准值1，则抗性种群菜青虫鱼尼丁受体基因表达量是敏感种群表达量的 6.32 倍。
2.3 间断饲喂对敏感菜青虫不同发育阶段鱼尼丁受体基因表达量的影响
用低于亚致死浓度的氯虫苯甲酰胺（0.02 mg/L ）间断饲喂3龄敏感菜青虫后，从图3中看出，处理后第8天，敏感菜青虫的鱼尼丁受体基因的表达量明显高于第 1、第4 和 第12天。由于处理后第 1、4、8、12天时分别对应菜青虫的3龄期、4龄期、蛹期和成虫期，因此该结果表明鱼尼丁受体基因在菜青虫蛹中的表达量显著高于在幼虫和成虫体内的表达量，而该受体基因在幼虫和成虫体内的表达量无显著差异。
2.4 连续和间断饲喂对敏感菜青虫鱼尼丁受体基因表达量的影响
由图4可知，处理后的第1天，连续组与间断组菜青虫鱼尼丁受体基因的表达量相差不大，随后两种处理的菜青虫鱼尼丁受体基因的表达量均显著上升，其表达量与对照组相比增加了0.80左右，随后表达量的变化趋于平稳。这表明连续饲喂可使菜青虫鱼尼丁受体基因持续高水平表达。而间断饲喂的菜青虫，在第8和第12天时体内鱼尼丁受体基因的表达量显著低于连续饲喂组中对应时间点的基因表达量。
3 讨 论
试验结果表明，用低剂量的氯虫苯甲酰胺间断或连续饲喂菜青虫，可显著提高菜青虫中鱼尼丁受体基因的表达水平。在之前的试验中发现用亚致死浓度（0.02 mg/L）的氯虫苯甲酰胺处理 3 龄菜青虫后发现，菜青虫体内的谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）的活性显著高于空白对照处理。而氯虫苯甲酰胺的抗性菜青虫种群的鱼尼丁受体基因表达量是敏感菜青虫种群的 6.32 倍。这与氯虫苯甲酰胺处理后解毒酶活性的变化趋势是一致的。而在间断饲喂4 d后鱼尼丁受体基因的表达量显著低于连续饲喂组中对应时间点的基因表达量。这可能与昆虫体内的解毒酶相关。因此，可以推断鱼尼丁受体基因表达量与解毒酶之间存在某种相关性，具体如何相关还需进一步研究。
由于昆虫的先天性免疫分为细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫依赖于血细胞调控的吞噬和包吞作用[14]。因此，血细胞对昆虫的免疫起着非常重要的作用。在昆虫的免疫反应中，细胞内的钙信号传导起着重要作用，已有研究表明果蝇中的鱼尼丁受体参与了体内钙的平衡和细胞的吞噬作用[15]。因此，作为调控细胞内钙离子通道的关键蛋白，鱼尼丁受体的基因表达对昆虫免疫反应的作用极为重要。试验还发现，氯虫苯甲酰胺可诱导菜青虫蛹中鱼尼丁受体基因的表达量增加，这可能也与该阶段昆虫的免疫反应有关。此外，假如氯虫苯甲酰胺是昆虫鱼尼丁受体潜在的激动剂，那么氯虫苯甲酰胺诱导菜青虫蛹中鱼尼丁受体基因的表达量也可能与其作为激动剂有关。
总的来说，试验通过荧光定量PCR技术证明了以鱼尼丁受体为靶标的氯虫苯甲酰胺可以诱导菜青虫鱼尼丁受体基因的表达，该结果对阐明氯虫苯甲酰胺的作用机理，为筛选作用于鱼尼丁受体靶标位点的化合物提供了参考和依据。
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（责任编辑：成 平）
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