材料与方法
1.1 试剂
TritonX100:上海市化学试剂厂产品;对硝基苯甲醚(P-NA)、对硝基酚:北京育才精细化工厂产品;碘化硫代乙酰胆碱、5,5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB): Sigma 公司产品;还原性谷胱甘肽(GSH):华美生物工程公司产品;十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、2,4-二硝基氯苯(CDNB):上海市试剂一厂产品;还原型辅酶Ⅱ(NADPH):上海Roche公司产品;苯甲基磺酰氟(PMSF):南京生兴技术公司产品;对硝基苯磷酸二钠、考马斯亮蓝:上海化学试剂站分装厂 Fluka 公司产品;95%高效氯氰菊酯原粉:江苏省农药研究所南京农药厂;2.85%高效氯氰菊酯纳米乳剂:原液由本中心自行研制,乳液呈淡黄色、外观透明均匀、流动性好,试样装瓶密封,于室温下长期静置存放,在自然状态下外观透明、无沉淀或分层,流动性和乳化性能均无变化。纳米乳剂平均粒径为11.2 nm。稀释液使用时现配;其它试剂均为国产分析纯或化学纯。
1.2 供试虫源
德国小蠊由江苏省疾病预防控制中心昆虫饲养室提供,为敏感株系的德国小蠊。
1.3 施药
对羽化后的健康德国小蠊的成年雄虫以微量进样器一次性以1 μl给药,保证在最短的时间内点药,将点药时间差造成的酶活性的差异降到最低。点滴0.000 1%(W/V)的高效氯氰菊酯普通乳剂(用CP级丙酮稀释)或0.000 1%(W/V)的高效氯氰菊酯纳米乳剂(用水稀释)于试虫胸腹背板上,使死亡率<5%。点滴后将试虫放入洁净果酱瓶中,正常饲养,以18 d为1个施药周期,另取10只敏感株系德国小蠊为空白对照,不给任何药物。
1.4 生存情况观察
观察给药后德国小蠊的生存情况,取走死亡的德国小蠊,并分别于给药后第1、2、3、4、8、13、18 天,每天取30只小蠊进行酶活性检测。加上施药后正常死亡的德国小蠊数10只以及对照组的10只,所以一个施药周期的样本量达到230只就可保证实验正常进行。
1.5 酶活性的测定
酶活性的测定均在反应量和反应时间呈直线关系的区段内进行。生成物的生成速度可反映酶活性,在反应量和反应时间呈直线关系的区段内,生成物的生成速度是指单位时间内每毫克蛋白对应产物的增加量。其中生成物是指各种检测酶在一定反应体系中生成的化学物质,对应产物是指具体检测酶相应的反应产物。
1.5.1 酶源制备
1.5.1.1 乙酰胆碱酯酶(AchE)酶液制备 德国小蠊施药后禁食24 h,用流动的蒸馏水冲洗2 min,然后放在滤纸上吸干,取头部,加磷酸盐缓冲液(pH 8.0,1/15 mol·L-1,含有0.5%的TritonX-100),冰浴匀浆,然后再以4 000 r·min-1(离心半径为5 cm)离心15 min,取上清液作酶液。
1.5.1.2 谷胱甘肽-S-转移酶(GST)酶液的制备 德国小蠊施药后禁食24 h,用流动蒸馏水冲洗2 min,然后放在滤纸上吸干,在4 ℃下解剖,去掉消化道中的食物,用中肠制备酶液。于磷酸盐缓冲(pH 6.5,0.1 mol·L-1)中冰浴匀浆,在10 000 r·min-1(离心半径为5 cm)离心15 min后,取上清液作酶液。
1.5.1.3 P450-O脱甲基酶酶液的制备 德国小蠊施药后禁食24 h,用流动的蒸馏水冲洗2 min,然后放在滤纸上吸干,在4 ℃下解剖,去掉消化道中的食物,用中肠制备酶液,加磷酸盐缓冲液冰浴匀浆(pH 7.8,0.1 mol·L-1,含1 mmol·L EDTA、1 mmol·L-1 DTT、1 mmol·L-1 PMSF),再以10 000 r·min-1(离心半径为5 cm)离心15 min后,取上清液作酶液。
1.5.2 酶活性的测定
1.5.2.1 AchE活性的测定 按Groun改进的Ellman方法,反应体系终体积为0.2 ml,100 μl的1/15 mol·L-1 pH 8.0的磷酸盐缓冲液,50 μl的0.75 mmol·L-1底物(碘化硫代乙酰胆碱),50 μl酶源(调整蛋白含量在40～80 μg·ml-1),30 ℃反应15 min,加入1.8 ml DTNB试剂,在412 nm波长下进行比色测定。
1.5.2.2 GST活性的测定 将100 μl酶液加入至反应体系中:磷酸缓冲液(pH 6.5,0.1 mol·L-1)2.5 ml,还原型GSH(100 mmol·L-1)0.1 ml,CDNB丙酮液(50 mmol·L-1)20 μl。混合均匀置于25 ℃条件下保温20 min后,加入0.5 ml SDS(2.5%)混匀,放置稳定10 min后,用紫外分光光度计于340 nm下,每隔1 min记录1次光密度值,共记录3 min。取3 min内光密度变化值计算反应速度,以反应速度表示酶活力[mOD·(mg·min)-1]。
1.5.2.3 P450-O脱甲基酶活性的测定 在96孔酶标板中每孔加入100 μl 2.0 mmol·L-1P-NA,10 μl 9.6 mmol·L-1NADPH和90 μl酶液,用酶标仪在412 nm波长下,每隔25 s记1次光密度值,共记录10 min。酶促反应阶段的温度为30 ℃。取光密度值0～0.2范围之间的数据计算反应速度,以反应速度表示酶活力[nOD·(mg·min)-1]。
1.5.3 蛋白浓度的测定
按Bradford方法,取0.1 ml酶液,加入5 ml考马斯亮蓝,在595 nm处测OD值,在标准曲线上查得其对应的蛋白浓度。1.6 统计学处理
数据以x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行重复测量资料的方差分析,检验水准为0.05。
2 结果与分析
2.1 高效氯氰菊酯纳米乳剂与普通乳剂的施药周期对德国小蠊AchE影响的比较
高效氯氰菊酯纳米乳剂组的AchE活性随施药时间延长呈抑制趋势,且与对照组酶活性经Dunnetts t检验均有统计学差异;而高效氯氰菊酯乳油组的AchE活性施药后也呈现出受抑制表现。采用SPSS 13.0软件按施药类型分组作重复测量资料的方差分析,对处理因素主效应(施药)进行分析结果可推断:高效氯氰菊酯纳米乳剂和普通乳油施药后的AchE活性变化是有差异的,即变化趋势不同(F=174.025,P<0.001)。见表1。
2.2 高效氯氰菊酯纳米乳剂和普通乳剂的施药周期对德国小蠊GST影响的比较
高效氯氰菊酯纳米乳剂对GST活性的抑制作用于第2天时达最大,随着施药周期延长酶活性呈现不稳定性的抑制状态;而高效氯氰菊酯乳油组GST的活性于施药后第2天抑制作用达到最大,而后逐渐恢复。采用SPSS 13.0软件按施药类型分组作重复测量资料的方差分析,对处理因素主效应(施药)进行分析结果可推断:高效氯氰菊酯纳米乳剂和普通乳油施药后的酶活性变化是有差异的,即两种剂型对德国小蠊GST活性的影响趋势不同(F=1 017.969,P<0.001)。见表1。
2.3 高效氯氰菊酯纳米乳剂和普通乳剂的施药周期对德国小蠊P450-O脱甲基酶影响的比较
施药第1天纳米乳剂组的P450-O脱甲基酶的活性即被抑制,而后稍有恢复,第3天又下降,呈现波动性抑制;而乳油组P450-O脱甲基酶的活性,施药后第4天受抑制作用最强。采用SPSS 13.0软件按施药类型分组作重复测量资料的方差分析,对处理因素主效应(施药)进行分析结果可推断:高效氯氰菊酯纳米乳剂和普通乳油施药后的P450-O脱甲基酶活性变化是有差异的,即变化趋势不同(F=1 364.271,P<0.001)。见表1。
3 讨 论
昆虫解毒酶能力的增强被认为是最普遍的抗性机制。解毒酶系中的酯酶、GST在某些情况下也是重要的抗性机制[3-4],曾晓等[5-6]的相关研究结果也证明了这一点。而拟除虫菊酯类杀虫剂的作用普遍认为主要是由于直接同神经膜上钠离子通道相互作用的结果。一些学者也认为这类杀虫剂同时也作用于其他的靶标位点,如Ca2+-2ATP酶、烟碱型乙酰胆碱受体等[7-10]。
而GST活性的升高势必造成德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂的耐药力增强和抗药性水平升高。不同浓度的高效氯氰菊酯引起德国小蠊GST活性的时序变化提示,在使用拟除虫菊酯类杀虫剂的过程中,必须考虑由此引起的德国小蠊耐药力变化问题,应合理控制用药浓度和科学制定施药时间,延缓德国小蠊抗药性的出现和延长杀虫剂的使用寿命。高效氯氰菊酯纳米乳剂施药后AchE活性出现反复波动,可能是由于纳米乳剂中含有高分子化合物[11]TritonX-100,纳米乳剂的有效成份高效氯氰菊酯被TritonX-100、SDS(表面活性剂)和无水乙醇(助乳化剂)包裹,施药后纳米乳剂中的有效成分必须透过包裹层逐步释放出来,因此释放缓慢,酶活性出现间断性抑制,从而表现为酶活性反复出现波动。纳米乳剂施药后GST活性也呈现出波动性抑制,且在施药周期内酶活性恢复状态较明显,提示小剂量多次接触纳米乳剂可能会使德国小蠊产生抗药性。P450-O脱甲基酶也出现和AchE、GST类似的酶活性波动性抑制情况,可能都是纳米乳剂的缓释效应,但其酶活性在第18天时受抑制作用仍较强,提示此种酶的恢复或改善作用较慢。
高效氯氰菊酯普通乳剂施药后AchE和GST都是先抑制而后酶活性逐渐恢复,虽然在施药周期内还未恢复至正常水平,但从恢复趋势可看出,若延长施药周期,可能就会恢复至正常酶活性水平。说明低剂量多次接触高效氯氰菊酯普通乳剂,AchE和GST酶活性会受高效氯氰菊酯普通乳剂诱导合成,造成其酶量恢复、受抑制的程度改善,从而降低德国小蠊对高效氯氰菊酯普通乳剂的敏感性。普通乳剂施药后GST在施药周期中期出现诱导现象可能是由于施药浓度(0.000 1%)较低,不能完全抑制酶活性,反而引起相关酶被激活活性升高。有研究表明抗性小菜蛾GST酶的活性明显高于敏感品系[12]。
综上所述,随施药时间的延长,高效氯氰菊酯纳米乳剂、普通乳剂对德国小蠊各种抗性酶活性呈现不完全相同的作用方式。
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