文章编号：1002-1302（2016）03-0031-05
小麦赤霉病（fusarium head blight，FHB）是我国小麦生产中最主要的病害之一，由镰刀菌属（Fusarium spp.）多种真菌引起[1]。在全世界范围内，禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是小麦赤霉病主要的病原菌，在2012年Molecular Plant Pathology上发表的十大病原真菌中，由于其发生的普遍性和重要性，居于第4位[2]。使用杀菌剂是控制赤霉病发生和危害的主要手段，通常用于防治小麦赤霉病的杀菌剂为苯并咪唑类杀菌剂多菌灵[3]。但是长期、单一、大量使用，使其产生了严重的抗药性，造成防效显著下降。因此，明确禾谷镰刀菌对唑类杀菌剂产生抗性机制具有重要的理论、生产实践价值。杀菌剂作用于甾醇生物合成中的14α脱甲基酶（CYP51），CYP51属于细胞色素P450（Cytochrome P450，简称CYP）家族第5类中唯一的一个家族，与P450其他家族相比，CYP51功能非常保守，作用于移除甾醇前体14α位的甲基，又称为甾醇14α脱甲基酶，催化酵母、真菌羊毛甾醇或齿孔醇，植物钝叶醇和哺乳动物二氢羊毛甾醇的14α位脱甲基反应，具有较强的底物特异性[4-6]。病原真菌中含有多个CYP51基因，对唑类药剂产生抗性的病原菌中，CYP51基因点突变是病原菌对唑类杀菌剂产生抗性的主要机制[7-9]。由于唑类杀菌剂中均含有1个含氮杂环，杂环上的氮原子可以与CYP51蛋白血红素-铁活性中心以配位键结合，竞争底物的结合位点，使酶的活性受到抑制。当唑类杀菌剂结合区域的氨基酸位点发生突变后，使药剂与CYP51蛋白的结合能力下降，引起病原菌的抗药性。在人类病原菌白色念珠菌（Candida albicans）点突变研究中已经证实了上述假设，如F145L[10]、Y132H、R467K[11]等突变。迄今为止，CYP51突变引起抗药性报道最多的真菌是C. albicans，其引起抗性的突变位点多达50个。对已报道的突变位点的位置进行分析，大部分突变位点集中在2个区域，分别为CYP51蛋白的N端、C端，这可能与蛋白折叠后的二级结构、三级结构中底物和药剂的结合位点有关[12]。CYP51蛋白N端包括α螺旋B、B′、C及其中间的Loop连接部分，在这个区域的点突变中，尤其以位于α螺旋B′和C之间的1个酪氨酸突变引起的抗性报道最多，包括C. albicans中CYP51的Y132F位点突变[13]，以及其他真菌斐济球腔菌（Mycosphaerella fijiensis）、白粉病菌（Blumeria graminis f. sp.）中的Y136F[14-15]，禾生球腔菌（Mycosphaerella graminicola）中的Y137F[16]，以及叶锈菌（Puccinia triticina）中的Y134F位点突变等[17]。M. graminicola中的Y137F突变使三唑醇不能够再与酶结合，引起抗性的发生[18]。第2个突变区域为 CaCYP51 蛋白氨基酸序列的428～459位或MgCYP51蛋白氨基酸序列的438～463位[19]。MgCYP51中保守位点Y459、G460及Y461的突变或/和缺失都能够引起唑类杀菌剂敏感性下降[20]。可见，CYP51蛋白氨基酸突变使病原菌对药剂产生抗药性。CYP51功能非常保守，但是不同生物中CYP51氨基酸序列的同源性不高，生物界之间其氨基酸的相似性只有 22%～30%；而同一生物界中，其氨基酸序列的同源性较高，在动物、植物、真菌中CYP51的相似性分别为64%、41%、42%[21]。禾谷镰刀菌含有3个CYP51基因FGCYP51A、FGCYP51B、FGCYP51C，这3个基因虽然序列同源性较高，却发挥着不同的功能。Fan等对这3个基因的功能进行了遗传学研究，发现FGCYP51A与FGCYP51B编码甾醇14α脱甲基酶，与病原菌对唑类杀菌剂的敏感性密切相关[22]。
目前，病原真菌中CYP51蛋白三维结构未见报道，且有关CYP51抗药性机制研究集中在基因遗传突变研究。因此，有必要从CYP51的蛋白结构入手研究其抗药性机制。解析蛋白质结构首先要对蛋白质进行分析，构建包含主要功能域的表达载体，进而体外纯化出高质量的目标蛋白，为后续生物学功能及生化功能试验奠定基础。本研究采用RT-PCR技术，克隆2个CYP51蛋白基因cDNA序列，利用生物信息学方法，对禾谷镰刀菌FGCYP51A、FGCYP51B基因编码的蛋白质进行分析，包括氨基酸组成、预测保守结构域、信号肽及跨膜结构域及亚细胞定位等，以期为进一步研究CYP51蛋白晶体结构及其生物学功能奠定基础。
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