超声强化提取红菊苣总黄酮及其抑菌活性

材料与方法

1.1 材料与仪器

红菊苣采自江苏省海洋生物产业园。供试微生物菌株包括大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、青霉菌（Penicillium notatum）、白假丝酵母菌（Candida spp.），均购于中国微生物保藏中心。

主要试剂包括芸香苷对照品，购于国药集团；试验用水为蒸馏水；试验所用试剂均为分析纯。

主要仪器有LC-5500型高效液相色谱仪，购于北京东西分析仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机，购于天津市泰斯特仪器有限公司；HZT-A+X型精密天平，购于上海鼎拓实业有限公司；超声仪，购于江苏省昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为水与甲醇（其体积比为30 ∶70），流速为 1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长360 nm，柱温25 ℃，理论塔板数按芸香苷峰计算应不低于3 000 个。

1.2.2 芸香苷标准曲线的绘制

准确称取芸香苷10.5 mg，在120 ℃下烘至恒质量，用70%色谱级甲醇溶液溶解稀释至50 mL，分别量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%色谱级甲醇溶液稀释至10 mL，摇匀，得到不同浓度梯度的标准溶液，将各标准溶液在“1.2.1”节中所述的检测条件下测定色谱峰面积。根据标准溶液浓度和对应测得的峰面积，制作出总黄酮含量对比基准。

1.2.3 红菊苣总黄酮的提取及其含量的测定

采集海洋生物园的红菊苣茎、叶，晾干，粉碎，80 ℃下干燥2 h，按一定固液比加入不同浓度乙醇提取溶剂，选取不同超声提取温度和提取时间，放入超声波仪中进行提取（提取时加回流装置，以防溶剂损失），趁热抽滤，收集提取液，加入与乙醇提取液体积比为1 ∶1的石油醚，萃取3～4次，脱去脂溶性杂质，将乙醇溶液层转入大孔吸附性树脂柱，原液与树脂量的比为 1 ∶2，依次用水、80%乙醇洗脱至溶液由浅黄色变为无色，收集乙醇溶液洗脱液，将洗脱液于50 ℃条件下碱液浓缩，得到红菊苣总黄酮浸膏。取所得浸膏，用70%色谱级甲醇溶液稀释成100 mL，摇匀，配制成待测溶液。

将所得待测溶液在“1.2.1”节中所述的检测条件下测得待测溶液的峰面积值，由标准曲线差查得该待测溶液浓度，即为待测液总黄酮含量，根据稀释倍数换算出红菊苣中的总黄酮含量。

1.2.4 红菊苣总黄酮提取工艺的L9（34）正交法试验设计

在单因素试验的基础上，根据正交试验设计原理，选出对红菊苣总黄酮含量影响较大的4个主要试验因素，考察红菊苣总黄酮含量。根据L9（34）正交设计方案进行试验，确定红菊苣总黄酮的最佳提取工艺条件。

1.2.5 抑菌试验

1.2.5.1 红菊苣总黄酮抑菌活性的测定[6-7]

将灭菌后的专用药敏纸片浸于50 mL浸提液中浸泡24 h，使其充分吸收提取液，以灭菌水为空白对照，采用纸片琼脂扩散法测定抑菌圈直径，以反映供试品的抑菌能力。取0.1 mL液体培养基以活化培养好的供试菌，用无菌玻璃刮棒均匀涂布于相应的琼脂培养平板上，用无菌镊子将含有提取液的纸片贴于含菌琼脂平板表面，纸片应贴得均匀，各纸片中心距离不小于 24 mm，纸片至平板内边缘距离大于15 mm。在放好滤纸片的含菌培养皿中恒温培养，其中细菌于37 ℃培养24 h，真菌于28 ℃培养 48 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。

1.2.5.2 最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定[8]

用无菌水将红菊苣总黄酮提取液稀释，终浓度分别为0256、0.128、0.064、0.032、0.016 mg/mL。取2 mL提取稀释液至15 mL培养基中，混匀，倒入平板，凝固后加入100 μL的100万～1 000万CFU/mL菌液，涂布均匀，放于相对湿度37%、温度28 ℃的条件下培养24 h后观察结果，菌落被完全抑制的最高稀释度提取物浓度即MIC；培养48 h后，菌落被完全抑制的最高稀释度提取物浓度为MBC。

2 结果与分析

2.1 芸香苷标准曲线

按照“1.2.1”节的方法绘制得到芸香苷标准曲线，由标准曲线可以得到总黄酮浓度与吸光度的回归方程：y=18 893x+38 546，r=0.997 2，可见在0～150 mg/L范围内总黄酮浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 红菊苣总黄酮提取工艺优化结果

在单因素试验基础上，根据正交试验设计原理，以料液比、超声功率、提取温度、乙醇浓度4个因素进行L9（34）正交试验（表1），对总黄酮提取工艺进行优化。

2.3 红菊苣总黄酮的抑菌试验结果

2.3.1 红菊苣总黄酮的抑菌活性测定结果

使用优化得到的方法提取红菊苣中的总黄酮，得到的浸提液经减压蒸发去除乙醇。采用纸片琼脂扩散法考察红菊苣总黄酮对几种模式微生物（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母、青霉菌）的抑制特性，抑菌试验结果见表3。试验结果表明，红菊苣总黄酮对青霉菌的抑菌效果最差，对白假丝酵母有一定的抑制作用，对潜在致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有很强的抑制作用，为红菊苣药物的抗菌临床应用提供了有力的证据并且有助于红菊苣的进一步药用开发。

3 结论

本研究采用超声波辅助提取法，以红菊苣总黄酮含量为考察指标，在单因素试验的基础上，采用正交试验法确定超声波辅助提取红菊苣总黄酮的最佳工艺提取条件为：料液比1 g ∶20 mL，超声功率200 W，提取温度70 ℃，乙醇浓度50%。在此条件下，总黄酮含量为21.042 mg/g。对红菊苣总黄酮提取液的抑菌效果试验结果表明，红菊苣总黄酮具有较强的抗菌作用，对革兰氏阴性和阳性细菌具有抑制作用，为红菊苣总黄酮的开发和利用提供参考。

参考文献：

[1]万碧珠，王文锋. 菊苣——饲料兼经济作物[J]. 中国种业，2002（6）：38-39.

[2]曹緯国，刘志勤，邵 云，等. 黄酮类化合物药理作用研究进展[J]. 西北植物学报，2003，23（12）：2241-2247.

[3]刘晓庆，张大勇，徐照龙，等. Cd胁迫对大豆幼苗异黄酮合成关键酶基因表达的影响[J]. 江苏农业学报，2013，29（5）：974-978.

[4]Wang J，Sun B G，Cao Y P，et al. Optimisation of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheaat bran[J]. Food Chemistry，2007，106（2）：804-810.

[5]Romdhane M，Gourdon C. Investigation in solid-liquid extration：influence of ultrasound[J]. Chemical Engineering Journal，2002，87（1）：11-19.

[6]慕立义. 植物化学保护研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1994.

[7]徐雅梅，呼天明，张存莉，等. 菊苣根提取物的抑菌活性研究[J]. 西北植物学报，2006，26（3）：615-619.

[8]曾超珍，刘志祥，韩 磊. 黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活性研究[J]. 时珍国医国药，2009，20（6）：1342-1343.

相关热词搜索： 超声 活性 提取 强化 抑菌