摘 要:阐述了LEICA TCS SP5共聚焦显微镜的组成、工作原理、样品制备方法,提出了该激光扫描共聚焦显微镜的日常维护和管理方法。
关键词:共聚焦显微镜 使用 管理
中图分类号:TN16文献标识码:A文章编号:1672-3791(2011)07(c)-0116-01
激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)是随着计算机技术和光电技术的飞跃发展,在20世纪80年代后期发展起来的。在生命科学研发中,LSCM技术已经成为生物医学中一个标准的研究工具。目前共聚焦显微镜的功能非常多,好像是一个科研工作站,其应用也大多在生命科学研究领域。围作为大型贵重精密仪器,LSCM的日常使用的管理需要按照严格的规程来实施,LEICA TCS SP5共聚焦显微镜的使用及管理方法如下。
1 了解仪器的组成
所有上机操作的人员必须经过培训,了解仪器组成、工作原理和操作规范方可上机。
1.1 仪器的组成
LEICA TCS SP5主要由四部分组成:(1)显微镜光学系统。为倒置显微镜;镜头包括共聚焦专用平场复消色差10×,20×,40×,63(油镜),100×(油镜)镜头;(2)扫描装置;(3)激光光源。本机器包含4个激光器:405nm激光,氩离子激光(457,476,488和514nm),561nm激光,氦氖633nm激光,共四个检测通道;(4)检测系统。整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活进行。由于激光器在工作时散发大量的热,需要风扇降温,突然断电可能烧坏激光器,因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。
1.2 工作原理
LSCM的工作原理是:照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,激光光源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,在这光路中,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的,不能通过小孔,只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。
2 清楚机器操作基本步骤
(1)打开稳压电源。
(2)依次打开电脑桌右侧电脑显微镜,扫描器、激光电源开关,将激光开关钥匙顺时针旋转90°至“On-1”位置。(各按钮间隔时间15s以上)。
(3)打开显微镜电源及荧光电源。
(4)启动徕卡共聚焦软件“LAS AF”。
(5)选择合适的物镜、视野。
(6)“TL/IL”功能键在明视场和荧光之间切换,通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块,进行样品的荧光观察。
(7)工具栏下方Configuration>Laser,根据染料的激发波长,选择所需激光。
(8)点击“Aquire”进行光路设置,可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测范围、调节PMT的gain或offset。
(9)单击“Additional Channels”以显示透射光检测器(“PMT Trans”),选择观察方法(BF、DIC等)。
(10)在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择扫描模式(“Acquisition Mode”),默认模式为xyz扫描,是最常用的扫描模式,可用于xy扫描和z轴层切(xyz扫描)。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由x,y,z,t(时间)以及λ(波长)组合而成的多维扫描模式,如xzy,xyt,xyλ,xyzt,xyzλ,xyzλt等。
(11)在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中设置扫描参数,包括分辨率、扫描速度、针孔大小、线平均、面平均、累加及放大倍数等。
(12)预览图像并优化参数。点击“Live”以设定的扫描参数预览图像,图像将显示在右侧的显示屏上。调节z轴位置找到最适合观察的焦平面,并调节PMT的电压及偏移,或激光输出功率使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。需注意参数对图像质量的正面和负面影响。
(13)采集图像并保存。单击“Capture Image”采集图像,注意:从获取第一张图片后就要开始保存,以后每获取一张图片都要保存一次,以免数据丢失。
(14)关闭显微镜汞灯电源。若使用过油镜,需用清洁液或无水乙醇清洁镜头。
(15)关闭LAS AF 软件,将激光开关钥匙逆时针旋转90°至“On-0”位置,依次关闭扫描器电源、电脑、显微镜电源。
(16)风扇停止后(关闭激光开关钥匙约15min后),关闭激光电源按钮。记录关机时间、仪器状况等信息。
3 样品准备合乎标准
3.1 细胞样品
细胞爬片制备:载玻片、盖玻片一定要选择质量好、光洁、无杂质的。重要实验,需要提前检查载玻片、盖玻片的光学特性,确保无荧光干扰。盖玻片的厚度应小于0．17mm,使用前需要用玻璃洗液浸泡处理一天以上,铬酸浸泡过夜,去离子水冲洗掉残存的洗液后,无水乙醇中浸泡待用。临用前在酒精灯上过火灭菌处理后,放置在细胞培养皿中,用于培养细胞。贴壁不牢的细胞(如293T),或者与细胞外基质相关的研究,玻璃片需预先包被细胞外基质,如poly-L-Lysine,Fibronectin,Laminin等。也可使用玻璃底的共聚焦专用培养皿,将细胞以104～105个/ml浓度接种于皿中进行检测。
3.2 组织样品
实验标本要求单层,并能很好地贴附在样品池中。所以,组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片,均为越薄越好。用于免疫荧光抗体标记组织切片的载玻片还需经过明胶、蛋白胶、多聚赖氨酸、硅烷等处理,以粘贴组织切片,防止组织切片在免疫反应过程中脱落。
3.3 样品的标记、固定剂和封片剂的使用
样品需经荧光探剂标记(可单标、双标、三标)。针对不同抗原结构特点选用固定剂。有机溶剂固定剂,如丙酮、甲醇,用于细胞支架成分的固定,有利抗体渗透,但部分抗原可能被抽提;交联剂固定剂,如多聚甲醛,用于膜相关成分的固定,结构保存好,但抗体渗透差。同时使用交联剂固定剂及有机溶剂打孔可较好的保存抗原而获得高质量的荧光图片。封片剂可防止样品荧光褪色、干燥及盖玻片脱落,如果临时封片,可以封于甘油+PBS(1∶1)中,永久封片可采用Mowiol(2．4gMowiol+6g甘油+6ml去离子水+12mlTris)封固。
4 日常维护
(1)温度和湿度的变化对光学系统影响非常大,因此仪器要有专门的实验室安放,做到干净、干燥、防震,室内安装空调和除湿机,温度恒定在21℃±1℃,避免阳光直射,使用结束后盖好防尘罩,工作人员出入仪器房要换鞋,换实验服。
(2)注意开机关机的顺序及激光管的保护,使用需预热约半小时,用完机器一定要等风扇停止运转再关机。
(3)使用完要做好清洁工作。
(4)需保养的部位:光学部件:物镜表面,目镜的上表面,聚光镜,底座光源出口,目镜筒内侧等;机械部件:主机架,载物台。
(5)显微镜要经常使用,长期不用应将主要光学部件放进防潮缸,潮湿地区的显微镜应安放防霉片。
(6)扫描后的图像及数据严禁用软盘拷贝,以防病毒浸染激光共聚焦显微镜系统。
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